Question

【题目】下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图中甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的不再重复标注。请回答下列问题。

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
识别序 列及切割 位点	G↓GATCC CCTAG↑G	T↓GATCA ACTAG↑T	↓GATC CTAG↑	A↓AGCTT TTCGA↑A

(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用限制酶为______，酶切后的载体和目的基因片段通过________酶作用后，获得重组质粒。

(2)若BclⅠ酶切的DNA末端与HindⅢ酶切的DNA末端可直接被DNA连接酶连接，原因是_______，这两种酶_____________(填“都能” “都不能”或“只有一种能”)切开连接的部位，原因是________________________。

(3)若用Sau3AⅠ切割图甲质粒最多可能获得______种大小不同的DNA片段。
(4)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图乙中的____________________________________。

Answer 1

【答案】BclⅠ和HindⅢ DNA连接 黏性末端相同 都不能 核苷酸序列不能再被BclⅠ和HindⅢ识别切割 7 四环素 引物A和引物C

【解析】

1、选择限制酶需注意插入目的基因时不能破坏标记基因。PCR扩增基因时，两种引物结合的部位相反，延伸的方向相反。限制酶具有特异性，不同的限制酶识别不同的序列，判断某种限制酶能否切割该片段，应该看该片段中是否含有限制酶的识别序列。

2、根据题意和图示分析可知：在质粒上存在BamH I、BclⅠ、 BamH I和HindⅢ等四个酶切位点，其中BamHI的切割位点在两个抗性基因上都有，Ⅰ而抗性基因为载体的标记基因，因此不可用该酶切割。在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和 Sau3A I四种酶也存在酶切位点。

(1)若选BamHⅠ和HindⅢ切割，则会破坏质粒中的两个抗性基因，不利于后期的筛选。选择的限制酶应在目的基因两侧切割，切割后的DNA片段用DNA连接酶连接。

(2)BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端可直接被DNA连接酶连接，原因是黏性末端相同，但是被DNA连接酶连接后便不能再被这两种限制酶切割了，因为不满足两种限制酶对其所识别序列的特异性要求。

(3)Sau3AⅠ在图甲质粒中一共有3个切点，考虑完全酶切和不完全酶切，最多可能得到7种不同大小的DNA片段。

(4)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素(根据标记基因的种类)，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物应具有成对反向的特点。