Question

【题目】pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建并广泛应用的大肠杆菌温控载体，大小为3 666 bp（bp表示碱基对），其结构如下图所示。图中PRPL是启动子，rrB是基因转录终止信号，Ampr是氨苄抗性基因，ori是质粒复制起点，EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ等为各种限制性内切酶。请据图回答下列有关问题：

（1）基因工程的核心步骤是____________________________________。

（2）从图中可看出，pBV220作为运载体具备的条件有_______________、____________。

（3）该质粒可被A、B、C三种限制性内切酶同时切割。单独A切割得一条长链，单独B切也得一条长链，A和C同时切割得2个500 bp和1个2 666 bp片段，B和C同时切割得2个250 bp和1个3 166 bp片段。若以A的切割位点为计算起点，则B的切割位点与A点最短长度为________，C的两个切割位点与A点的最短距离分别为________、________

（4）PR和PL都是启动子，pBV220载体构建过程中把两个启动子串联在一起，形成了双启动子，双启动子的作用可能是_________________________。温控基因CIts857编码对温度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃时具有抑制启动子的活性，在42℃时失活。促进工程菌目的基因表达的诱导温度为________。

Answer 1

【答案】构建目的基因的表达载体 多个限制性内切酶的切割位点 标记基因 750 bp 500 bp 1 000 bp 保证目的基因的高水平表达（高效转录） 42℃

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

4、目的基因的检测与鉴定：

（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。

（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

（1）基因工程的核心步骤是构建目的基因的表达载体。

（2）从图中可看出，pBV220作为运载体具备的条件有具有多个限制性内切酶的切割位点（便于目的基因的插入）、标记基因（便于鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞）。

（3）单独A切割得一条长链，单独B切也得一条长链，A和C同时切割得2个500bp和1个2666bp片段，B和C同时切割得2个250bp和1个3166bp片段，这说明该质粒上有一个A酶切割位点、一个B酶切割位点、2个C酶切割位点。A和C同时切割得2个500bp和1个2666bp片段，说明A和C酶的一个切点之间的长度为500bp，B和C同时切割得2个250bp和1个3166bp片段，说明B和C酶的一个切点之间的长度为250bp，若以A的切割位点为计算起点，则B的切割位点与A点最短长度为500+250=750bp，C的两个切割位点与A点的最短距离分别为500bp、1000bp。

（4）PR和PL都是启动子，pBV220载体构建过程中把两个启动子串联在一起，形成了双启动子，双启动子的作用可能是保证目的基因的高水平表达（高效转录）．温控基因CIts857编码对温度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃时具有抑制启动子的活性，在42℃时失活，因此要促进工程菌目的基因表达就要使CIts蛋白失活，即促进工程菌目的基因表达的诱导温度为42℃。