Question

1．研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂--内皮抑素，它能有效地抑制血管增生．下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题．
（1）从肝细胞中分离总RNA，经反转录获得cDNA，之后经过PCR扩增内皮抑素基因．
（2）扩增的目的基因与pUC18质粒（如图所示）都用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒．双酶切避免了目的基因与载体反向连接，还减少了目的基因和运载体的自身的连接，提高了重组质粒的比例．
（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落．反之，则形成白色菌落．选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入IPTG、X-gal和氨苄青霉素物质．成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成白颜色的菌落，原因是重组质粒上的LacZ基因已被破坏而不能表达．之所以选择大肠杆菌作为基因工程的受体菌，其突出的优点是：大肠杆菌是单细胞生物，繁殖速度快，遗传物质相对较少．
（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物．将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37℃培养．将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72h后在显微镜下观察细胞存活情况并对活细胞进行计数，实验结果如表所示．

粗提表达产物浓度/（μg•mL-1）	0	2	4	6	8	10
活的内皮细胞数目（×102）	12	6	2	1	0.5	0.5

实验结果说明内皮抑素能有效地抑制血管增生．

Answer 1

分析 此题考查了基因工程技术，目的基因的获得方法有三种：从基因文库中获取、PCR技术扩增、人工合成法；基因表达载体中的LacZ基因被插入灭活．

解答 解：（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经反转录（或逆转录）获得内皮抑素基因，再利用PCR技术进行体外扩增，以获得更多的目的基因．
（2）双酶切后，目的基因两端的黏性末端不同，被切开的运载体两端的黏性末端也不同，这样可以避免目的基因与载体反向连接，还能减少目的基因与目的基因、载体与载体的连接，还减少了目的基因和质粒的自身连接，提高了重组质粒的比例．
（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落．反之，则形成白色菌落．选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有IPTG、X-gal和氨苄青霉素．因为重组质粒的LacZ基因中插入了目的基因，使LacZ基因不能表达出β-半乳糖苷酶，所以成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成白色菌落．基因工程中选择大肠杆菌作为受体细胞的原因是大肠杆菌是单细胞生物，繁殖速度快，遗传物质相对较少．
（4）由表中数据可知，粗提表达产物浓度越高，活的内皮细胞数目越少，说明重组内皮抑素（或粗提表达产物）能够抑制毛细血管内皮细胞的增殖．
故答案为：
（1）反转录   PCR 
（2）反向   目的基因和运载体自身
（3）IPTG、X-gal和氨苄青霉素   白    重组质粒上的LacZ基因已被破坏而不能表达     大肠杆菌是单细胞生物，繁殖速度快，遗传物质相对较少
（4）对活细胞进行计数   内皮抑素能有效地抑制血管增生

点评 本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生的理解应用能力和信息转化能力，属于中等难度题．