Question

【题目】图1为某一质粒载体，外源DNA分子插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。图2中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点。回答下列有关基因工程的问题：

(1)经Sau3A I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____酶切后的产物连接，理由是_____________。

(2)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_____。用DNA连接酶处理限制酶切产物得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。首先用含有_____培养基进行筛选，上述大肠杆菌细胞中，_____不能在培养基生存，但是含有______的细胞也是不能区分的，其原因是_______________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_____________的固体培养基。

Answer 1

【答案】BamHⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 T4DNA连接酶 四环素 未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌 质粒载体和插入了目的基因的重组质粒 二者均含有四环素抗性基因，在该培养基上均生长 氨苄青霉素

【解析】

1、运载体：

（1）常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。

（2）作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。

2、识图分析可知，图1中的质粒上Amp′表示氨苄青霉素抗性基因，Tet′表示四环素抗性基因，可以作为标记基因，限制酶EcoR I、BamH I的酶切位点位于Amp′氨苄青霉素抗性基因中。

图2依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，分析图可知，限制酶BamH I和Sau3A I切割后形成的黏性末端序列可以互补配对。

（1）分析图解可知，限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切割后形成的黏性末端相同，因此经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。

（2）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，包括T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是仅含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒。由于BamHⅠ酶会破坏青霉素抗性基因，因此含有目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能产生抗青霉素物质，四环素抗性基因没有破坏，能产生抗四环素的物质，因此该大肠杆菌能抗四环素素而不能抗氨苄青霉素; 仅含有环状目的基因的没有标记基因存在，因此既不能抗青霉素也不能抗四环素；含有质粒载体的既可以抗青霉素也可以抗四环素。所以首先用含四环素的培养基分离微生物，其中未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌不能在培养基生存，但是含有质粒载体和插入了目的基因的重组质粒的细胞能够生存下来，二者不能区分，若要区分二者，还需使用含有氨苄青霉素的培养基筛选，其中含有质粒载体的能够生存。