Question

【题目】蜘蛛丝中强度最好的牵引丝由主壶腹腺蛛丝蛋白（MaSp）组成。MaSp包括MaSp1、MaSp2两个组分。完整的MaSp1蛋白可分NT、RP、CT三个部分。研究者以大腹园蛛MaSp1的NT等为研究对象做了相关实验，以期了解大腹园蛛MaSp1的结构和成丝机理。实验流程图如图所示。请回答问题：

（1）蜘蛛冻存之前通常要用灭菌蒸馏水清洗、饥饿等处理，其目的是______________；取冻存大腹园蛛的胸部组织捣碎，提取该蜘蛛的______________。

（2）在仅知黑寡妇蜘蛛和摩鹿加云斑蛛MaSp1基因编码序列的情况下，研究者对比两者NT中的氨基酸序列，根据其中共有的一段含有7个氨基酸的保守序列，推测对应的DNA序列，据此设计出长度为________个碱基的引物1。获取该引物常用________方法。

（3）利用PCR技术扩增目的基因时，经25～30轮扩增循环后，由于模板的增多，________的数量会逐渐成为制约反应持续进行的主要限制性因素。

（4）流程图中的空白处指构建________，然后将该结构导入________态的大肠杆菌。

（5）分离、纯化NT蛋白时，为何不直接从培养液中提取，而是将表达该蛋白的工程菌破碎？_______________________________________

Answer 1

【答案】减少外源DNA的干扰 基因组DNA 21 化学方法（人工）合成 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 基因表达载体（ 或重组质粒） 感受 大肠杆菌（缺少信号肽、内质网、高尔基体等）不分泌NT蛋白

【解析】

1、PCR技术的基本原理利用DNA体外双链复制的原理，其特异性依赖于与靶序列两端互补的引物。

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

2、基因工程的操作步骤：提取目的基因、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

（1）蜘蛛冻存之前通常要用灭菌蒸馏水清洗、饥饿等处理，其目的是减少外源DNA的干扰，获取目的基因的方法包括从自然界已有的物种中分离和人工合成法，因此取冻存大腹园蛛的胸部组织捣碎，可以从中提取该蜘蛛的基因组DNA。

（2）根据题意可知，研究者对比两者NT中的氨基酸序列，根据其中共有的一段含有7个氨基酸的保守序列，推测对应的DNA序列，根据氨基酸与密码子的对应关系可知，则设计出引物的长度为7×3=21个碱基的引物1，常用化学合成法合成引物。

（3）根据以上分析可知，PCR扩增过程中需要的条件为：模板、引物、热稳定的DNA聚合酶、dNTP为反应原料等，因此经25～30轮扩增循环后，由于模板的增多，热稳定DNA聚合酶的数量会逐渐成为制约反应持续进行的主要限制性因素。

（4）识图分析可知，图纸空白处为基因表达载体的构建，基因表达载体构建完成后导入受体细胞，大肠杆菌为微生物，可以用钙离子转化法处理，使大肠杆菌处于感受态，便于吸收周围环境中的DNA分子。

（5）由于大肠杆菌为原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器，不能对分泌蛋白进行加工和分泌，因此大肠杆菌不能分泌NT蛋白，故分离、纯化NT蛋白时，不直接从培养液中提取，而是将表达该蛋白的工程菌破碎处理后提取。