GDNF是一种神经营养因子．对损伤的神经细胞具有营养和保护作用．研究人员构建了含GDNF基因的表达载体.并导入到大鼠神经干细胞中.用于干细胞基因治疗的研究．请回答:(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中.使用胰蛋白酶的目的是使细胞分散开．(2)构建含GDNF基因的表达载体时.需选择图1中的XhoⅠ限制酶进行酶切．(3)经酶切后的载� 题目和参考答案——青夏教育精英家教网—

1．GDNF是一种神经营养因子．对损伤的神经细胞具有营养和保护作用．研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究．请回答：

（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是使细胞分散开．
（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的XhoⅠ限制酶进行酶切．
（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）．为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示．图中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的．
（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的抗体与提取的蛋白质杂交．当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验．

分析 1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．
2、动物细胞培养的过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养．

解答解：（1）胰蛋白酶的作用是消化组织细胞间的物质，使组织分散成单个细胞．
（2）根据题意和图示分析可知：由于GDNF基因两边都有XhoⅠ限制酶识别序列，所以构建含GCDNF基因的表达载体时，需选择图1中的XhoⅠ限制酶进行酶切．
（3）选择HpaⅠ酶和BamⅡ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片透进行电泳分析，结果如图2所示，由于GDNF基因中有BamⅡ酶识别序列，所以图中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的．
（4）为了检测GDNF基因是否成功表达，可利用抗原-抗体杂交技术，用相应的抗体与提取的蛋白质杂交，当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于细胞干细胞移植治疗实验．
故答案为：
（1）使细胞分散开
（2）XhoⅠ
（3）②
（4）抗体传代

点评本题考查基因工程、动物细胞培养的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤等，掌握各步骤中的相关细节，能结合所学的知识准确判断各选项．

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