Question

【题目】Rag2 基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。科研人员利用胚胎干细胞（ES 细胞）对 Rag2 基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如图：

（1）步骤①中，在核移植前应去除卵母细胞的_____。小鼠体细胞体外培养时， 所需气体主要是 O2 和 CO2，其中 CO2 的作用是维持培养液（基）的_____。

（2）步骤②中，重组胚胎培养到_________期时，可从其内细胞团分离出 ES 细胞。体外培养条件下，ES 细胞在_____细胞上，能够维持只增殖不分化的状态。

（3）步骤③中，需要构建含有 Rag2 基因的表达载体。可以根据 Rag2 基因的__________设计引物，利用 PCR 技术扩增 Rag2 基因片段。PCR 过程需要经过多次循环，每一个循环包括：加热变性→冷却复性→_____，其中冷却复性的目的_________。用 HindⅢ和 PstⅠ限制酶分别在片段两侧进行酶切获得 Rag2 基因片段。为将该片段 直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有_____酶的酶切位点。

（4）为检测 Rag2 基因的表达情况，可提取治疗后小鼠骨髓细胞的_____，用_______________的抗体进行杂交实验。

Answer 1

【答案】细胞核 pH值（或酸碱度） 囊胚 饲养层 核苷酸序列 加热延伸 使引物与互补链结合 HindⅢ和PstⅠ 蛋白质； 抗Rag2蛋白

【解析】

分析题图：图示是利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗的过程图解，其中①表示核移植过程，②表示早期胚胎培养过程，③表示采用基因工程技术将目的基因导入受体细胞。

（1）步骤①中，在核移植前应去除卵母细胞的细胞核。小鼠体细胞体外培养时，所需气体主要是O2和CO2，其中CO2的作用是维持培养液（基）的pH值（或酸碱度）。
（2）囊胚期才出现内细胞团，内细胞团细胞具有发育的全能性，属于胚胎干细胞；体外培养条件下，ES细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中，能够维持只增殖不分化的状态。
（3）步骤③中，需要构建含有Rag2基因的表达载体。可以根据Rag2基因的核苷酸序列设计引物，利用PCR技术扩增Rag2基因片段。PCR过程需要经过多次循环，每一个循环包括：加热变性→冷却复性→加热延伸，其中冷却复性的目的使引物与互补链结合。构建基因表达载体时，应该用同种限制酶切割外源DNA和运载体，因此用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在片段两侧进行酶切获得Rag2基因片段。为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位点。
（4）为检测Rag2基因的表达情况，可采用抗原﹣抗体杂交法，即提取治疗后小鼠骨髓细胞的蛋白质（抗原），用抗Rag2蛋白的抗体进行杂交实验。