Question

【题目】为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。

（1）研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用__________技术从陆地棉基因文库中获取酶D基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因。在上述引物设计时，分别在引物中加入上图所示酶的识别序列，这样可以用____________________酶处理两个基因后，得到____________端（填图中字母）相连的融合基因。

（2）将上述融合基因插入右图所示Ti质粒的T－DNA中，构建_______________并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含______________的固体平板上培养得到单菌落，再利用液体培养基震荡培养，可以得到用于转化的浸染液。

（3）剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是_________________________，进一步筛选后培养获得转基因油菜。

（4）提取上述转基因油菜的mRNA，在____________酶的作用下获得cDNA，再依据融合基因的DNA片段设计引物进行扩增，对扩增结果进行检测，可判断融合基因是否________。

Answer 1

【答案】PCR ClaⅠ（限制酶）和DNA连接 A、D 表达载体（或“重组质粒”） 四环素 利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞 逆转录 转录

【解析】

1、基因文库包括cDNA文库、基因组文库等。某个群体包含一种生物所有的基因的文库叫基因组文库，而用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA片段属于cDNA文库。

2、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。同种限制酶切割能够产生相同的黏性末端，便于质粒和目的基因连接。

（1）扩增目的基因常用PCR技术。切割获得酶D基因和转基因肽基因时，应该用同种限制酶，以获得相应的黏性末端。因此，可用ClaⅠ限制酶和DNA连接酶处理两个基因后，得到A、D端相连的融合基因。
（2）将上述融合基因插入右图所示Ti质粒的T-DNA中，构建基因表达载体即重组质粒并导入农杆菌中。由于质粒上含有四环素抗性基因作为标记基因，所以将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到单菌落。

（3）剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞。
（4）提取上述转基因油菜的mRNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA，再依据融合基因的DNA片段设计引物进行扩增，对扩增结果进行检测，可判断融合基因是否完成转录。