Question

【题目】2019年底爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由SARS-CoV-2病毒引起的，能否快速、准确地检测出病原体成为疾病防控的关键。请回答：

（1）下图表示SARS-CoV-2病毒检测的部分流程。科学家以病毒的RNA为模板通过①____________过程合成cDNA，再对cDNA进行PCR扩增，这项技术称为RT-PCR。

（2）进行RT-PCR需要加入的酶是____________和___________。要从cDNA中扩增出新冠病毒特有的基因序列ORF1ab和核壳蛋白基因N关键在于要加入__________、dNTP及所需的酶一起构成反应体系。

（3）RT-PCR加入Taqman荧光探针可以通过测定荧光强度来检测产物浓度，原理如下：Taqman荧光探针为一段与_____________互补的核苷酸单链，两端分别连接一个荧光基团R和一个淬灭基团Q。探针结构完整时，R发射的荧光被Q吸收；而PCR扩增时结合在模板链上的探针被切断，使R和Q分离，R基团发射的荧光不被淬灭，这样通过对荧光信号强弱的监测就可实现对产物的检测。荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有病毒的概率越____________。

（4）一次核酸检测历时需16小时，为快速检测可采用抗原-抗体杂交技术，这一技术的关键是要生产出能与新冠病毒结合的特异性抗体.请写出生产这种抗体的思路：__________________。

Answer 1

【答案】逆转录（或：反转录） 逆转录酶 Taq酶 （ORF1ab和核壳蛋自基因N）的特异性引物 目的基因 大 ①向小鼠体内注射新冠病毒的抗原蛋白（或灭活的新冠病毒）：②提取免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经多次筛选获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞；③将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养、或注射到小鼠腹腔内增殖，从培养液或小鼠腹水中就提取大量的单克隆抗体

【解析】

1.将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性、低温复性、适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链式反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

2.单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原的抗体。通常采用单克隆抗体技术来制备，单克隆抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的效应B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能产生抗体，又能无限增殖。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原的特异性抗体即单克隆抗体。

（1）以RNA为模板合成DNA的过程为逆转录或反转录，故题图中以病毒的RNA为模板合成cDNA的过程为①逆转录，再对cDNA进行PCR扩增，这项技术称为RT-PCR。

（2）RT-PCR是扩增DNA的过程，因为加入的模板是RNA，故需要加入的酶是逆转录酶和Taq酶。要从cDNA中扩增出新冠病毒特有的基因序列ORF1ab和核壳蛋白基因N关键在于要加入（ORF1ab和核壳蛋自基因N）的特异性引物、dNTP及所需的酶一起构成反应体系，从而实现了相关基因的扩增。

（3）RT-PCR加入Taqman荧光探针可以通过测定荧光强度来检测产物浓度，原理如下：Taqman荧光探针为一段与目的基因互补的核苷酸单链，两端分别连接一个荧光基团R和一个淬灭基团Q。探针结构完整时，R发射的荧光被Q吸收；而PCR扩增时结合在模板链上的探针被切断，使R和Q分离，R基团发射的荧光不被淬灭，这样通过对荧光信号强弱的监测就可实现对产物的检测。若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病毒的概率越大。

（4）若采用抗原-抗体杂交技术进行病毒检测，需要制备能与新冠病毒结合的特异性抗体，单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高且能够大量制备的优势，故设计的思路是设法获得能产生该特异性抗体的杂交瘤细胞，步骤如下：①向小鼠体内注射新冠病毒的抗原蛋白（或灭活的新冠病毒），目的是要获得能能产生特异性抗体的效应B细胞；②提取免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经多次筛选获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞；③将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养、或注射到小鼠腹腔内增殖，从培养液或小鼠腹水中可以提取大量的单克隆抗体。