Question

【题目】图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamHI和Sau3AI三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoRI、Sau3AI的切点是唯一的）。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被_____________酶切后的产物连接，理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端是 ___________________________________

（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有______，不能表达的原因是_____________________________________________________________________________。

（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_____________。

Answer 1

【答案】Sau3AⅠ -——CTAG 甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 E．coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶

【解析】

1、“分子手术刀”--限制性核酸内切酶（限制酶）：
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2、“分子缝合针”--DNA连接酶：
（1）两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：EcoliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。
（2）与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

（1）分析图解可知，限制酶Sau3AI和BamHI酶切割后形成的黏性末端相同，均为-——CTAG，因此经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AI酶切后的产物连接。
（2）在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，插入到启动子和终止子之间的目的基因才能表达，而图中甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，甲和丙的结构均不符合目的基因表达的条件，所以不能在宿主细胞中表达目的基因产物。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。