Question

4．1994年，科研人员发现一株拟南芥突变株，由于NPR1基因突变，使其系统获得性抗性相关蛋白基因的应答性表达被彻底破坏，后来采用定位克隆技术从拟南芥中克隆到了NPR1基因，发现它的表达与植物抗细菌和真菌毒性提高有关．以NPR1基因作为目的基因可人工获得抗性植株．请回答：
（1）抗性相关蛋白基因的应答性表达过程包括转录和翻译两个步骤．从野生拟南芥中分离出NPR1基因的mRNA后，以其为模板可逆转录出目的片段，然后用PCR技术可实现目的片段的克隆．与生物体内的DNA复制相比，PCR技术的特殊之处有离体条件、需要高温或高温酶（答出两项）等．
（2）由于DNA复制时，子链只能由5'向3'方向延伸，故利用PCR扩增NPR1基因时，可以从图1的A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C作为引物．PCR扩增进行50个循环后，理论上可以产生约为2⁵⁰个DNA分子，将这些DNA分子与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做拟南芥的cDNA文库（或部分基因文库），扩增获得的目的基因与拟南芥细胞中该基因碱基序列不同（填“相同”或“不同”）．

（3）将人工合成的NPR1基因导入普通植物之前，需要构建含有NPR1基因的基因表达载体．对NPR1基因片段和质粒（图2所示）进行酶切时，可选用限制酶的组合为HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ．

Answer 1

分析 1、基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键．
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒．
3、PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成．
4、根据图1、2显示：SmaI切割位点在绿色荧光蛋白基因上并会破坏NPR1基因，不能使用SmaI．又因为在NPR1基因左端只有PstI一种酶的切割位点，在右侧有HindIII、EcoRI2个切割位点，因此对NPR1基因片段和质粒（图2所示）进行酶切时，可选用限制酶的组合为HindⅢ和PstI或EcoRⅠ和Pst．

解答 解：（1）基因表达过程包括转录和翻译两个步骤．以mRNA为模板，通过逆转录产生单链DNA，再进一步产生双链DNA，即目的基因片段．PCR技术与生物体内的DNA复制相比，PCR技术的特殊之处有：离体条件、需要高温或高温酶等．
（2）DNA分子两条链是反向平行的关系，又因为DNA复制时子链只能由5'向3'方向延伸，因此A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C作为引物．PCR扩增以2ⁿ形式扩增，进行50个循环后，理论上可以产生约为2⁵⁰个DNA分子．这些DNA只是某生物体部分DNA，因此将这些DNA分子与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做拟南芥的cDNA文库（或部分基因文库）．这些DNA分子中不含有非编码区、内含子，扩增获得的目的基因与拟南芥细胞中该基因碱基序列不同．
（3）将人工合成的NPR1基因导入普通植物之前，需要构建含有NPR1基因的基因表达载体．根据图1、2显示：SmaI切割位点在绿色荧光蛋白基因上并会破坏NPR1基因，不能使用SmaI．又因为在NPR1基因左端只有PstI一种酶的切割位点，在右侧有HindIII、EcoRI2个切割位点，因此对NPR1基因片段和质粒（图2所示）进行酶切时，可选用限制酶的组合为HindⅢ和PstI或EcoRⅠ和Pst．
故答案为：
（1）转录和翻译      逆转录     离体条件、需要高温或高温酶
（2）B和C           2⁵⁰cDNA文库（或部分基因文库）     不同
（3）含有NPR1基因的基因表达载体      HindⅢ和PstⅠEcoRⅠ和PstⅠ

点评 本题考查DNA分子的结构和基因工程的相关知识，解题前提是熟记基因工程的原理、操作工具和操作步骤，之后根据图中的信息，推断出构建基因表达载体所需的限制酶．本题要求考生具有一定的识记能力和分析能力，难度适中．