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    【题目】抗凝血酶Ⅲ蛋白是一种血浆糖蛋白，临床上主要用于血液性疾病的治疗。凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。下列是生产这两种酶的相关思路，请回答下列问题：

    （1）图1为通过培育转基因奶牛获得抗凝血酶Ⅲ蛋白的流程。

    ①图中过程a指的是利用________法将目的基因导入受精卵，受体细胞不选用体细胞的理由是________________。

    ②在胚胎移植前，需进行____________，目的是确定要培育的个体能产奶。

    ③可采用________法来鉴定牛奶中是否含有抗凝血酶Ⅲ蛋白。

    （2）从牛胃液中分离得到的凝乳酶以其催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。

    ①从牛胃细胞中提取mRNA，再通过________形成cDNA。以此cDNA为模板通过PCR扩增目的基因，有时需要在引物的5′端设计________（填“限制酶”、“DNA连接酶”或“RNA聚合酶”）识别序列，以便构建重组DNA分子。

    ②为提高重组DNA分子的比例，在构建重组DNA分子（如图2所示）时最好选用______________作限制酶。

    ③经研究发现，如果将该凝乳酶的第20位和24位氨基酸变为半胱氨酸，则其催化能力将提高2倍。现已知通过蛋白质工程可生产高效凝乳酶，请写出有关制备步骤：________________________。

    【答案】（1）①显微注射 动物体细胞的全能性一般不能表现 ②性别鉴定 ③抗原—抗体杂交

    （2）①逆转录 限制酶 ②BamH Ⅰ和PstⅠ ③找到相对应的脱氧核苷酸序列→定向改造凝乳酶基因→将改造后的凝乳酶基因导入受体细胞等（答案合理即可）

    【解析】

    试题分析：（1）图1是培育转基因牛的简易流程图，所以a过程指的是将目的基因导入受精卵，采用的方法为显微注射法。动物体细胞的全能性一般不能表现，所以选择受精卵作为受体细胞。只有母牛才能产奶，所以进行胚胎移植前需要对胚胎进行性别鉴定。鉴定牛奶中是否含有目标蛋白，常采用抗原—抗体杂交法。（2）以RNA为模板获得DNA的过程称逆转录。PCR技术用于快速扩增目的基因，而基因工程中只需用限制酶来切割DNA。 目的基因两末端碱基序列不同以及切开的质粒两末端碱基序列不同才能避免各自的自连，进而提高重组DNA的比例。

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