Question

【题目】穿梭载体是一类具有两种不同复制原点、能在两种不同的生物体（物种不同）中复制的载体，一般在原核生物和真核细胞中都能复制和表达，如Ti质粒和哺乳动物表达质粒pMT2。回答下列问题。

（1）构建基因表达载体前，需先获取目的基因。PCR技术可用于目的基因的扩增，其原理是 ________。用PCR技术从基因文库中获取并扩增目的基因，需要加入人工合成的___做为引物；PCR反应体系中需加入的原料是____。

（2）若要构建一个穿梭质粒，使其能够在大肠杆菌中大量复制，且能在哺乳动物细胞中表达，质粒上除启动子、终止子、多个限制酶酶切位点和标记基因外，还需要有____的复制原点。

（3）下图为某种哺乳动物穿梭质粒示意图，现欲使用该质粒表达人生长激素，但人生长激素基因所在的DNA片段上不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的人生长激素基因定向插入该质粒，扩增的人生长激素基因两端设计的序列应含有____（填下图中的限制酶名称）的切割位点。

（4）将该穿梭质粒、目的基因混合后形成的重组质粒与感受态的大肠杆菌细胞混合，完成转化过程，再从培养的大肠杆菌细胞中提取质粒，可获得大量该质粒。在含卡那霉素的培养基中能够生长的大肠杆菌细胞中____（填“一定”或“不一定”）含有目的基因，原因是____。

Answer 1

【答案】DNA双链复制 一小段单链DNA 4 种脱氧核苷酸 大肠杆菌和哺乳动物 NdeⅠ和BamHⅠ 不一定 若大肠杆菌细胞中导入的是未携带目的基因的（穿梭）质粒，大肠杆菌细胞也能在含卡那霉素的培养基中生长

【解析】

1、PCR技术：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。

（1）原理：DNA复制；

（2）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物；

（3）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；

（4）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。

2、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。其原理是DNA双链复制。在PCR反应体系中，需加入一小段已知核苷酸序列的DNA单链，以便合成引物；需加入四种脱氧核苷酸作为合成DNA的原料。扩增过程是在较高温度下进行的，因此需要加入耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。

（2）基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。穿梭载体具有两种不同复制原点，构建一个能够在大肠杆菌中大量复制，且能在哺乳动物细胞中表达的穿梭质粒，需要加入大肠杆菌和哺乳动物的复制原点。

（3）如果在哺乳动物的穿梭质粒中插入人生长激素基因，基因表达载体中目的基因的上游为启动子，下游为终止子。图示启动子和终止子之间的限制酶有NdeI、XbaI、BamHI三种，其中XbaI有两个酶切位点，一个位点在终止子下游，所以为使PCR扩增的人生长激素基因定向插入该质粒，扩增的人生长激素基因两端设计的序列应含有NdeⅠ和BamHⅠ的切割位点。

（4）穿梭质粒、目的基因混合后，导入到大肠杆菌细胞的有可能是没有携带目的基因的穿梭质粒，其上含有卡那霉素抗性基因，在含有卡拉霉素的培养基中能够生长，所以在含卡那霉素的培养基中能够生长的大肠杆菌细胞中不一定含有目的基因。