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    6．如表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的而不重复标注．请回答下列问题．
    限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ
    识别序列及切割位点

    （1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用限制酶为BclⅠ和HindⅢ，酶切后的载体和目的基因片段通过DNA连接酶作用后获得重组质粒．
    （2）若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端可直接被DNA连接酶连接，原因是黏性末端相同，这两种酶都不能（选填“都能”“都不能”或“只有一种能”）切开连接的部位，原因是核苷酸序列不能被BclⅠ和HindⅢ识别切割．
    （3）若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段．
    （4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙．

    分析 解答本题的关键在于理解重组质粒中标记基因的作用．选择限制酶需注意插入目的基因时不能破坏标记基因．PCR扩增基因时，两种引物结合的部位相反，延伸的方向相反．限制酶具有特异性，不同的限制酶识别不同的序列，判断某种限制酶能否切割片断，应该据该片段中是否含有限制酶的识别序列．
    根据题意和图示分析可知：在质粒上存在BamH I、BclⅠ、BamH I和HindⅢ等四个酶切位点，其中BamH I的切割位点在两个抗性基因上都有，而抗性基因为载体的标记基因，因此不可用该酶切割．在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和Sau3AⅠ四种酶也存在酶切位点．

    解答 解：（1）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，且会破坏质粒中的两个抗性基因；Sau3A I在质粒上有三个酶切位点，也会破坏质粒中的两个抗性基因，不利于后期的筛选，所以应选用限制酶为BclⅠ和HindⅢ．选择的限制酶应在目的基因两侧切割，切割后的DNA片段用DNA连接酶连接．
    （2）BamHⅠ酶切得DNA末端与BclⅠ酶切得DNA末端可直接被DNA连接酶连接，原因是黏性末端相同（即同尾酶），但是被DNA连接酶连接后便不能再被这两种限制酶切割了，因为不满足两种限制酶对识别序列的特异性要求．
    （3）根据BamHⅠ、BclI和Sau3A I的酶切位点，Sau3A I在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段．
    （4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素（根据标记基因的种类），平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物应具有成对反向的特点．
    故答案为：
    （1）BclⅠ和HindⅢDNA连接
    （2）黏性末端相同    都不能    核苷酸序列不能被BclⅠ和HindⅢ识别切割
    （3）7
    （4）四环素    引物甲和引物丙

    点评 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲应用和理解层次的考查．

    练习册系列答案
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