Question

3．下面是一项“利用转基因番茄生产人胰岛素的方法”的专利摘要，请回答：
本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素．所用的人胰岛素基因是依据植物偏爱密码子的原则来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在C端加上KDEL的内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解．将该基因置于CaMV 35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素．
（1）此基因工程中的目的基因是人胰岛素基因，将人工合成的DNA片段拼接在一起，所需要的酶是DNA连接酶，T₄-DNA连接酶还可以连接平末端．
（2）要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用PCR扩增技术（用字母）．
（3）试分析在C端加上KDEL的内质网滞留序列，为什么可以避免胰岛素在植物细胞中的降解？使胰岛素合成后在植物内质网中保存，以免在细胞内被降解．
（4）用目的基因与农杆菌的Ti质粒结合构建表达载体，该表达载体的组成中不应含有的是④⑦（从下列选项中选择）．
①目的基因   ②CaMV 35S启动子  ③果实专一性启动子2A12   ④RNA引物
⑤标记基因   ⑥T-DNA            ⑦RNA聚合酶基因片段      ⑧终止子
（5）若培育转基因动物，用显微注射法，将目的基因导入受精卵中．要确定目的基因是否整合到染色体上，一般需用放射性同位素标记（或荧光分子标记）的目的基因（单链）做探针，与转基因小鼠细胞中提取的核DNA进行分子杂交．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素，目的基因为人的胰岛素基因．将人工合成的DNA片段拼接在一起，所需要的酶是DNA连接酶，其中T₄DNA连接酶来源于T₄噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端．
（2）PCR技术可以在体外大量扩增目的基因片段．
（3）在C端加上KDEL的内质网滞留序列，可使胰岛素合成后在植物内质网中保存，这样可以避免胰岛素在植物细胞中的降解．
（4）根据题干信息“通过农杆菌介导的方法”可知，转基因操作时所用的载体是农杆菌的Ti质粒，载体上的T-DNA可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上．基因表达载体包括启动子（CaMV 35S启动子和果实专一性启动子2A12）、目的基因、标记基因和终止子．
（5）受体细胞是动物细胞，常用显微注射法，受体细胞是受精卵．确定目的基因是否整合到染色体上，一般需用放射性同位素标记（荧光分子标记）的目的基因（单链），与转基因小鼠细胞中提取的基因组DNA（核DNA），进行DNA分子杂交，通过是否产生杂交链来检测．
故答案为：
（1）人胰岛素基因        DNA连接酶       T₄-DNA连接酶
（2）PCR扩增
（3）使胰岛素合成后在植物内质网中保存，以免在细胞内被降解
（4）④⑦
（5）显微注射  受精卵  放射性同位素标记（或荧光分子标记）的目的基因（单链）

点评 本题以“利用转基因番茄生产人胰岛素的方法”的专利摘要为题材，考查基因工程和植物细胞工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，识记植物组织培养的原理及应用，能结合题中信息准确答题．