Question

16．Rag₂基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞．科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag₂基因缺失小鼠进行基因治疗．其技术流程如图1，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示质粒，据图回答：

（1）重组细胞的细胞核来自（Rag₂基因缺失小鼠的）上皮细胞．
（2）将基因导入ES细胞而不是导入上皮细胞是因为ES细胞具有全能性．
（3）步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团分离出ES细胞．
（4）步骤③中，需要构建含有Rag₂基因的表达载体．可以根据Rag₂基因的核苷酸序列设计引物，利用PCR技术扩增Rag₂基因片段．
（5）对于干扰素基因片段和质粒进行双酶切时，可选用限制酶的组合为HindIII和PstI或EcoRI和PstI．
（6）将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发绿色荧光的细胞进行体外诱导．为检测干扰素基因是否表达，可以采用抗原-抗体杂交的方法．

Answer 1

分析 分析图1：图示是利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag₂基因缺失小鼠进行基因治疗的过程图解，其中①表示核移植过程，②表示早期胚胎培养过程，③表示采用基因工程技术将目的基因导入受体细胞．
分析图2、3：限制酶SamI的切割位点位于目的基因中，因此构建基因表达载体时，不能用限制酶SamI切割，应该用限制酶HindIII和PstI或限制酶EcoRI和PstI分别在目的基因两侧进行酶切．构建基因表达载体时破坏了红色荧光蛋白基因，但没有破坏绿色荧光蛋白基因．

解答 解：（1）由图可知，重组细胞的细胞核来自（Rag₂基因缺失小鼠的）上皮细胞．
（2）将基因导入ES细胞而不是导入上皮细胞是因为ES细胞具有全能性．
（3）胚胎干细胞来自早期胚胎（囊胚的内细胞团）和原始性腺．因此，步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团分离出ES细胞．
（4）PCR操作中，根据目的基因（Rag₂基因）的核苷酸序列设计引物．
（5）基因工程中构建基因表达载体时，应用同种限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体．因为限制酶SamI的切割位点位于目的基因中，因此构建基因表达载体时，不能用限制酶SamI切割，应该用限制酶HindIII和PstI或限制酶EcoRI和PstI分别在目的基因两侧进行酶切．
（6）由于构建基因表达载体时破坏了红色荧光蛋白基因，但没有破坏绿色荧光蛋白基因，则导入重组质粒的受体细胞能发出绿色荧光，但不能发出红色荧光，因此选择发绿色荧光的细胞进行体外诱导．检测目的基因是否表达，可以采用抗原-抗体杂交法．
故答案为：
（1）（Rag₂基因缺失小鼠的）上皮细胞
（2）全能性
（3）囊胚
（4）核苷酸序列
（5）HindIII和PstI      EcoRI和PstI 
（6）绿     抗原-抗体杂交

点评 本题结合图解，综合考查基因工程、细胞工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题；识记核移植的具体过程；识记体外受精的具体过程及早期胚胎发育的过程，能结合所学的知识准确答题．