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    3．大肠杆菌是人和动物肠道中普遍存在的一种兼性厌氧菌，在无氧条件下，大肠杆菌通过发酵能将葡萄糖转变为多种有机酸并产生CO2等气体．某研究机构使用“滤膜法”对受污染的河流水体进行了大肠杆菌活菌数目的测定．请回答：
    （1）研究人员向葡萄糖蛋白胨培养液中加入适量的溴麝香草酚蓝水溶液的条件下培养一段时间后可观察到溶液颜色的变化为由蓝变绿再变黄，并且在倒置的小管中出现气泡．
    （2）测定大肠杆菌活菌数目时，需制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，该培养基中为细菌提供氮源的物质是牛肉膏和蛋白胨．为了鉴别大肠杆菌菌落，可向培养基中加入伊红美蓝作为指示剂．
    （3）为了便于统计污染严重的水体中活菌的数目，需将水样进行适当稀释，例如取水样1mL加入无菌水99mL制备稀释倍数为102的稀释液，并照此依次制备更高倍数的稀释液．每个稀释倍数的菌液取10mL进行过滤，然后将滤膜放置在培养基上．为了防止杂菌污染，稀释、过滤和旋转滤膜等操作都应该在酒精灯火焰附近进行．
    （4）将放有滤膜的平板置于适宜条件下培养，每隔12h统计一次菌落数目，应选取菌落数目稳定时的记录作为结果．如果经过培养后稀释倍数为102的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48（4个平板上接种的稀释液均为0.1mL），那么每升河水中约含大肠杆菌4.5×107 个．用这种方法测定的细菌数量比实际活菌数量要少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落．

    分析 1、二氧化碳可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄．
    2、培养各种微生物的培养基的具体配方不同，但一般都含有碳源、氮源、水和无机盐．
    3、伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料，大肠杆菌在含有伊红美蓝培养基上形成的菌落呈深紫色（黑色），并有金属光泽，伊红美蓝是专一鉴别大肠杆菌的指示剂．
    4、常用的纯化微生物时的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法．
    5、稀释涂布平板法能用于微生物的计数，其计算公式为：1毫升（克）样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（毫升），M代表稀释倍数；用稀释涂布平板法对微生物计数往往比活菌的实际数目低，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落．

    解答 解：（1）由题干“在无氧条件下，大肠杆菌通过发酵能将葡萄糖转变为多种有机酸并产生CO2等气体”，向葡萄糖蛋白胨培养液中加入适量的溴麝香草酚蓝培养一段时间的大肠杆菌，可产生CO2气体，CO2可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄，并且在倒置的小管中出现气泡．
    （2）用牛肉膏蛋白胨固体培养基培养细菌时，培养基中的牛肉膏和蛋白胨能为细菌提供氮源；伊红美蓝是专一鉴别大肠杆菌的指示剂，为了鉴别大肠杆菌菌落，可向培养基中加入伊红美蓝作为指示剂．
    （3）用稀释涂布平板法进行对微生物计数时，当样品的稀释度足够高时，培养基表面的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌，若将水样稀释102倍，可取水样1mL加入到99mL的无菌水中进行稀释；为了防止杂菌污染，整个操作过程应进行无菌操作，所以在稀释、过滤和旋转滤膜等操作时都应该在酒精灯火焰附近进行．
    （4）统计培养的菌落数目时应选取菌落数目稳定时的记录作为结果，如果经过培养后稀释倍数为102的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48，则平板上平均菌落数=（43+47+42+48）÷4=45个，每毫河水中约含大肠杆菌数=（C÷V）×M=（45÷0.1）×102=4.5×104个，每升河水中约含大肠杆菌数=4.5×104×103=4.5×107个；用稀释涂布平板法测定的细菌数量比实际活菌数量要少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落．
    故答案为：
    （1）由蓝变绿再变黄 气泡
    （2）牛肉膏和蛋白胨 伊红美蓝
    （3）99 酒精灯火焰
    （4）稳定 4.5×107 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落

    点评 本题考查微生物的培养、分离和计数的知识，考生识记所列知识点，并能运用所学知识做出合理的判断或得出正确的结论是解题的关键．

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