Question

【题目】科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、Hind Ⅲ、Alu Ⅰ等四种限制性核酸内切酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：

（1）在构建重组DNA时，可用一种或多种限制性核酸内切酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性核酸内切酶分别对、进行切割，切割后产生的DNA片段分别为、种。
（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使Ⅰ重组DNA中含有作为标记基因。
（3）研究人员通常采用法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。

Answer 1

【答案】
（1）PstI、SmaI,含鱼抗冻蛋白基因的DNA,质粒,4,2
（2）抗氨苄青霉素基因
（3）农杆菌转化
【解析】解： （1）在构建基因表达载体中，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用不同的限制酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的黏性末端，故应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割，PstⅠ和SmaⅠ在鱼抗冻蛋白基因的DNA上共有3个酶切位点，切割后产生4个DNA片段，而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生2个DNA片段。（2）能在含氨苄青霉素的培养基中细胞具有抗氨苄青霉素基因，故基因表达载体Ⅰ中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因。（3）将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法。

（1）分析题图，鱼的抗冻蛋白基因上，Pst Ⅰ酶的切割点在目的基因的两侧，Sma Ⅰ酶的切割点在目的基因的左侧，而Alu Ⅰ酶的切割点在目的基因的中间，因此，只能用Pst Ⅰ酶和Sma Ⅰ酶。
（2）操作的基本步骤：提取目的基因→目的基因与运载体结合→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
植物组织培养的过程：

据此可知图中①表示表达载体的构建，②表示目的基因导入受体细胞，③表示脱分化，④表示再分化。
（3）常用的转化方法：
①植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。
②动物：显微注射技术。
③微生物：感受态细胞法。