Question

16．GDNF是一种神经营养因子．对损伤的神经细胞具有营养和保护作用．研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究．请回答：

（1）完成图中A过程必需的工具是限制酶和DNA连接酶；该基因治疗的受体细胞为神经干细胞．
（2）基因工程最核心的步骤是构建基因表达载体．
（3）若要构建含GDNF基因的表达载体，则需选择图中的XhoⅠ限制酶进行酶切．
（4）限制酶XhoI和限制酶HpaI的识别序列及切割位点分别是-C↓AATTG-和-G↓AATTC-．如下图表示四种质粒，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因．适于作为图示GDNF基因运载体的是A．

（5）下列有关限制性核酸内切酶和质粒运载体的描述，正确的是C．
A．限制性核酸内切酶能识别DNA、切割DNA任一序列
B．限制性核酸内切酶的作用部位与RNA聚合酶的相同
C．使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解
D．质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的
（6）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图所示）．为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，若是正向连接的重组载体，其产生的酶切片段数为2个，反向连接的重组载体产生片段有②⑥（多选）．
①100bp  ②200bp  ③600bp   ④700bp  ⑤6000bp  ⑥6500bp．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）图中A表示基因表达载体的构建过程，该过程中需要先用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，其次还需要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA分子；根据题干信息“导入到大鼠神经干细胞中”可知，该基因治疗的受体细胞为神经干细胞．
（2）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体．
（3）质粒上有XhoⅠ识别位点，而且在启动子之后，所以要构建含GDNF基因的表达载体，应选用XhoⅠ限制酶进行酶切．
（4）A、该质粒中含有限制酶XhoI的切割位点，且切割位点不在标记基因上，可作为基因的运载体，A正确；
B、该质粒不含标记基因，不可位于基因的运载体，B错误；
C、该质粒含有标记基因和限制酶HpaI，但切割位点位于标记基因上，用该酶切割后会破坏标记基因，因此不能作为基因的运载体，C错误；
D、该质粒含有标记基因和限制酶XhoI，但切割位点位于标记基因上，用该酶切割后会破坏标记基因，因此不能作为基因的运载体，D错误．
故选：A．
（5）A．限制性核酸内切酶具有特异性，一种限制酶只能识别特点的DNA序列，并在特定的位点进行切割，A错误；
B．限制性核酸内切酶的作用是切断脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，而RNA聚合酶的作用是在核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键，B错误；
C．使用质粒运载体是为了将目的基因导入受体细胞，避免目的基因被分解，C正确；
D．质粒运载体可能是由细菌的DNA改造形成的，但不是由病毒的DNA改造形成的，D错误．
故选：C．
（6）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）．为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，若属于载体自连，且产生的酶切片段只有一种；若是正向连接的重组载体，其产生的酶切片段数为2个，且长度分别与质粒和GDNF基因长度相同；若是反向连接的重组载体，经过BamHⅠ酶切后产生两种长度的片段，即200bp和6500bp．
故答案为：
（1）限制酶和DNA连接酶    神经干细胞
（2）构建基因表达载体
（3）XhoⅠ
（4）A   
（5）C  
（6）2    ②⑥

点评 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤等，掌握各步骤中的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲理解和应用层次的考查．