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    13．如图表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图1表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspI、BamHI、MboI、SmaI 4种限制性核酸内切它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．

    （1）若用限制酶SmaI完全切割图中含有目的基因D的DNA片段，其产物长度分为537、790、661． 若图2DNA分子中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从隐形纯合子中分离出图示对应的DNA片段，用限制酶Sma I完全切割，产物中共有2种不同长度的DNA片段．
    （2）为了提高试验成功率，需要通过PCR技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝．在目的基因进行扩增时，加入的引物有A、B两种，若该目的基因扩增n代，则其中含有A、B引物的DNA分子有2n-2个．
    （3）若将图中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是BamH1．
    （4）为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，首先将大肠杆菌在含抗生素B的培养基上培养，得到如图3示的菌落．再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含抗生素A的培养基上培养，得到如图4的结果（空圈表示与图3对照无菌落的位置）．挑选目的菌的位置为图2培养基中对应图3中消失的菌落．
    （5）若目的基因在工程菌中表达产物是一条多肽链，如考虑终止密码，则其至少含有的氧原子数为340．

    分析 分析图1：图中DNA片段含有2个限制酶SmaⅠ切割位点，可被限制酶SmaⅠ切割产生长度为534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp的三中DNA片段．
    分析图2：质粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割．用限制酶BamHⅠ切割破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因，因此含有重组质粒的大肠杆菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A．

    解答 解：（1）根据图1中的酶切位点，可判断用限制酶SmaⅠ完全切割该DNA片段，其产物长度为537bp、790bp、661bp．若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，基因D就突变为基因d，那么基因d上只有一个限制酶SmaⅠ切割位点，被限制酶SmaⅠ切割的产物长度为534+796-3=1327kb、658+3=661bp．因此从隐性纯合子（dd）分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有2种不同DNA片段．
    （2）为了提高试验成功率，需要通过PCR技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝．由于PCR技术运用了DNA复制的原理，因此目的基因扩增n代后产生子代DNA分子2n．又由于亲代DNA分子的两条链中不含引物，因此含有A、B引物的DNA分子有2n-2 个．
    （3）由图1可知，目的基因两侧是GGATCC序列，该序列是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将质粒和目的基因D连接形成重组质粒，应选用限制酶BamHⅠ切割．
    （4）用限制酶BamHⅠ切割质粒后，用限制酶BamHⅠ切割破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因，因此首先用含有抗生素B的培养基培养大肠杆菌，能生存下来的是含有普通质粒和重组质粒的大肠杆菌；再用含有抗生素A的培养基培养，能生存下来的是含有普通质粒的大肠杆菌．最后能在培养皿1上生存，但不能在培养皿2上生存的大肠杆菌菌落进行培养，即可得到含重组质粒的大肠杆菌．图3中空心圈在图2中对应的位置是含目的基因的重组质粒的大肠杆菌的菌落．
    （5）基因D含有1020对碱基，最多能翻译形成含有1020÷3-1（终止密码子）=339个氨基酸的多肽链．多肽链含有O原子数=肽键数+2肽链数+R基中的O原子数，所以该多肽至少含有O原子数为338+2×1=340个．
    故答案为：
    （1）537、790、661    2     
    （2）PCR      2n-2     
    （3）BamH1       
    （4）抗生素B    抗生素A   图2培养基中对应图3中消失的菌落     
    （5）340

    点评 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤，能结合图中限制酶的识别序列判断所选限制酶的种类，再根据抗性基因进行筛选，同时能结合图中和题中的数据答题．

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    F2株数

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    白花

    蓝花

    白花

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    263

    0

    752

    49

    ②蓝花×白花

    84

    0

    212

    71

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