Question

【题目】透明质酸酶是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。下图是利用重叠延伸PCR技术获得新透明质酸酶基因的过程，NcoI和XhoI为限制酶识别位点。请分析回答下列问题：

（1）图中新透明质酸酶基因的获得是重叠延伸PCR技术在__________(基因敲除／基因的定点突变／融合基因的构建)方面的应用。透明质酸酶基因上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该段核苷酸序列进行剪切的XhoI酶识别的核昔酸序列(6个核苷酸)为___________________。

（2）构建透明质酸酶基因表达载体时，使用的载体往往有特殊的标记基因，其作用是_________________；所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列________(有／没有)专一性要求。早期利用大肠杆菌作为受体细胞，后来发现毛霉或酵母菌更具优势，最可能的原因是_________________________。

（3）人体细胞间质有基膜粘连蛋白、多糖(如透明质酸)、蛋白多糖等成分。动物细胞培养时将取出的组织块分散成单个细胞的做法为____________________。链球菌等致病菌在侵染人体时，可产生透明质酸酶，试分析透明质酸酶在链球菌侵染过程中的作用是______________，其意义可能是____________________________________

Answer 1

【答案】基因的定点突变 -CTCGAG- 或 -GAGCTC- 供重组DNA的鉴定和选择 没有 (毛霉酵母菌)是真核细胞，有内质网和高尔基体加工 剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间 分解宿主细胞间质的主要成分（或分解宿主细胞间质的透明质酸） 破坏宿主的防御系统，利于致病菌入侵(或为细菌提供能源物质)

【解析】

1、PCR过程有三个步骤：目的基因DNA受热变性后解旋为单链，引物与单链相应互补序列结合，在DNA聚合酶作用下延伸。

2、基因工程一般要经历四个步骤：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

3、动物细胞培养的过程：取动物组织块——剪碎组织——用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞——制成细胞悬液——转入培养液中（原代培养）——放入二氧化碳培养箱培养——贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞制成细胞悬液——转入培养液（传代培养）——二氧化碳培养箱。

（1）重叠延伸PCR技术是一种基因的定点突变技术。限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。XhoI限制酶识别的序列及位点是5，-CTCGAG-3，中的C、T位点。所以若透明质酸酶基因上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该段核苷酸序列进行剪切的XhoI酶识别的核昔酸序列为-CTCGAG- 或 -GAGCTC- 。

（2）表达载体的构建一般含有特殊的标记基因，其含有的标记基因的作用是便于重组DNA的鉴定和选择。DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来，所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。用毛霉或酵母菌替代大肠杆菌作为受体更具有优势，是因为毛霉和酵母菌为真核生物，有对目的基因表达产物进行加工的内质网和高尔基体，产生的透明质酸酶是具有生物活性的。

（3）动物细胞培养时先取出动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织），再剪碎，再用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间使其分散成单个细胞。链球菌等致病菌在侵染人体时，可产生多种酶，如透明质酸酶等，能溶解细胞间质的透明质酸、纤维蛋白和其他蛋白质，破坏纤维所形成的脓肿壁，这样能破坏宿主的防御系统，利于致病菌入侵。