Question

【题目】稻瘟病是水稻最重要的病害之一，为达到防治目的，科研人员通过转基因技术培育出了抗稻瘟病水稻品种。回答下列问题：

（1）通过 RT-PCR 技术以抗稻瘟病基因的 RNA 为模板扩增出 cDNA。在 PCR 过程中，两个引物是_____酶的结合位点；用 cDNA 单链与该抗性水稻植株的单链 DNA 进行分子杂交，可能出现游离的单链区，其原因是_____。

（2）利用 RT-PCR 技术扩增基因时，设计两种引物的碱基序列的主要依据是_____，为了便于扩增后的X 基因与质粒连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶酶切位点，主要目的是_____。

（3）基因工程中，将重组质粒导入植物细胞采用最多的方法是_____，导入动物受精卵采用的方法是_____。

（4）若要检测抗稻瘟病基因是否翻译出相应蛋白质，可采用的分子水平的检测方法是_____。

Answer 1

【答案】热稳定DNA聚合 DNA分子含有内含子非编码区等序列，mRNA分子中没有相应互补的碱基序列 X基因两端的部分脱氧核苷酸序列 使X基因能定向插入表达载体，减少自连 农杆菌转化法 显微注射法 抗原-抗体杂交

【解析】

1、有关PCR技术的相关知识：

（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。

（2）原理：DNA复制。

（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。

（4）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。

2、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）在PCR过程中，两个引物是热稳定DNA聚合酶的结合位点；用cDNA单链与该抗性水稻植株的单链DNA进行分子杂交，由于DNA分子含有内含子、非编码区等序列，mRNA分子中没有相应互补的碱基序列，因此逆转录形成的cDNA中缺少该序列，所以出现游离的单链区。

（2）用PCR技术扩增X基因时，设计两种引物的碱基序列的主要依据是X基因两端的部分脱氧核苷酸序列，为了便于扩增后的X基因与质粒连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶酶切位点，主要目的是使X基因能定向插入表达载体，减少酶切产物自身环化。

（3）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，将质粒上的T-DNA转移到受体细胞。将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，这也是将目的基因导入动物细胞最有效的方法。

（4）若要检测抗稻瘟病基因是否翻译出相应蛋白质，分子水平上可采用抗原-抗体杂交法进行检测。