Question

【题目】蚯蚓富含金属硫蛋白（MT），能吸收土壤中的镉。现通过基因工程技术把MT基因导入烟草植株并高效表达，以清除土壤中的镉。下图是科学家培育转MT基因烟草的流程图。请回答下列问题：

（1）过程①是用提取的mRNA为材料来获得cDNA，其原理是______________________。需要获得MT基因的核苷酸序列，以便根据序列合成_____________用于PCR扩增。

（2）过程②分别用两种限制酶剪切MT基因和质粒，使_________________，保证了MT基因与质粒定向连接。构建重组质粒时，DNA连接酶催化形成的化学键是____________。

（3）过程③可以利用__________处理农杆菌，以利于重组质粒进入。在培育转MT基因烟草的过程中，农杆菌的作用是_____________________________________。

（4）为检测烟草植株中是否转录出了mRNA，可用_________________________与提取出的烟草mRNA杂交，看是否出现杂交带。

Answer 1

【答案】在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则来合成cDNA 引物 MT基因、质粒片段的两端产生不同的黏性末端 磷酸二酯键 Ca2+ 农杆菌能感染烟草，将MT基因转移到烟草受体细胞中 标记的MT基因作探针

【解析】

识图分析可知，图示表示科学家培育转MT基因烟草的流程图，图中①过程是以mRNA为模板合成cDNA的过程，即逆转录法，该过程需要逆转录酶的催化作用；图中②过程为构建重组质粒的过程，需要限制酶切割磷酸二酯键产生末端，同时需要DNA连接酶将切开的DNA分子片段之间的磷酸二酯键恢复，从而形成重组质粒；过程③是将重组质粒导入农杆菌的过程，一般采用感受态细胞法处理，用一定浓度的Ca2+溶液处理农杆菌，使其处于感受态，便于吸收周围环境中的DNA分子。然后再用农杆菌侵染烟草的细胞，在农杆菌T-DNA的作用下将目的基因转移到受体细胞染色体的DNA上，完成转化过程。检测目的基因是否导入受体细胞可以采用DNA分子杂交法，检测目的基因是否转录可以采用分子杂交法，检测目的基因是否翻译，采用抗原-抗体杂交法。

（1）根据以上分析可知，过程①是通过逆转录法获取目的基因的过程，原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则来合成cDNA。在PCR扩增的过程中，需要获得MT基因的核苷酸序列，以便根据序列合成引物。

（2）过程②分别用两种限制酶剪切MT基因和质粒，选择两种限制酶切割可以使MT基因、质粒片段的两端产生不同的黏性末端，防止自身的环化和目的基因与质粒之间的反向连接，保证了MT基因与质粒定向连接。构建重组质粒时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。

（3）过程③是将重组质粒导入农杆菌的过程，一般采用感受态细胞法，用一定浓度的Ca2+溶液处理农杆菌，使其处于感受态，以利于重组质粒进入。在培育转MT基因烟草的过程中，利用了农杆菌转化法，即在农杆菌T-DNA的作用下将目的基因转移到受体细胞染色体的DNA上，完成转化过程。

（4）为检测烟草植株中是否转录出了mRNA，可用分子杂交法，即以标记的MT基因作探针，与烟草细胞中提取出的总mRNA进行杂交，如果产生杂交带即说明完成了转录过程。