Question

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

  （1）一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有   ▲   个游离的磷酸基团。

  （2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越   ▲   。

  （3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna Ⅰ切割，原因是   ▲   。

  （4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止   ▲   。

  （5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入   ▲   酶。

  （6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了   ▲   。

  （7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在   ▲   的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

Answer 1

（1）0、2

（2）高

（3）SmaI会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因

（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化

（5）DNA连接

（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞

（7）蔗糖为唯一含碳营养物质

解析:

（1）因为该质粒为环状，所以在没有经过SmaⅠ切割前，其不含游离的磷酸基团；当被SmaⅠ酶切割后该质粒变成以一条DNA分子，含有两条单链，而在每条单链的5^′端会都含有一个游离的磷酸基团。

（2）因为对该该质粒进行改造是只插入SmaⅠ酶切位点，相对于质粒的热稳定性而言，含有的C-G碱基对越多，则所含的氢键越多，其热稳定性越高。

（3）在质粒和目的基因上都有一个SmaⅠ酶的内切位点，当使用SmaⅠ酶时，会导致质粒上的抗生素抗性基因、目的基因被破坏。抗生素抗性基因被破坏会导致后期在筛选时无法根据抗性基因进行筛选，目的基因被破坏则导致无法得到相应的目的基因的产物。

（4）因为如果只使用同一种限制性内切酶，则形成的黏性末端都相同，质粒可以和目的基因进行重组，同时质粒也可以与质粒重组、目的基因也可与目的基因重组，这样就达不到试验的目的。

（5）质粒与目的基因都是DNA，要想将两个DNA连接在一起，则需要使用DNA连接酶。

（6）载体中一般需要用抗性基因作为标记基因，这样有利于在后期对含有目的基因的细胞进行筛选。

（7）由于该细胞已经丧失了对蔗糖吸收的能力，所以只有导入重组质粒的细胞能够吸收蔗糖，故只能在培养基中加入蔗糖作为其碳源，为其提供营养物质。