Question

16．Rag₂基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞．科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag₂基因缺失小鼠进行基因治疗．其技术流程如图：

（1）步骤①中所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中期．
（2）步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显的特点．
（3）步骤③中，需要构建含有Rag₂基因的表达载体．可以根据Rag₂基因的核苷酸序列设计合成引物，利用PCR技术技术扩增Rag₂基因片段．用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在目的基因所在DNA片段两侧进行酶切获得Rag₂基因片段．为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位点．
（4）为检测Rag₂基因的表达情况，可提取治疗后小鼠骨髓细胞的蛋白质，用抗Rag₂蛋白的抗体进行杂交．

Answer 1

分析 1、动物核移植的概念：将动物的一个细胞的细胞核移入一个去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体．
2、胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）．
3、在基因工程中，目的基因和质粒需要用同种限制酶进行切割，形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接成重组质粒．
4、目的基因分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术
②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术
③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术

解答 解：（1）步骤①核移植中所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中期．
（2）胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）．故步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显的特点．
（3）步骤③中，需要构建含有Rag₂基因的表达载体，设计引物要遵循碱基互补配对原则，所以根据Rag₂基因的核苷酸序列进行设计．Rag₂基因是利用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割获得的，所以表达载体应具有HindⅢ和PstⅠ的酶切位点．
（4）基因表达的产物是蛋白质，所以提取小鼠骨髓细胞的蛋白质进行抗原-抗体杂交．
故答案为：
（1）减数第二次分裂中
（2）内细胞团   细胞体积小，细胞核大，核仁明显
（3）表达载体  引物  PCR   HindⅢ和PstⅠ
（4）杂交

点评 题以基因治疗的流程图为载体，考查了基因工程、细胞工程以及胚胎工程等方面的知识，难度适中．考生要能够识记细胞核移植的过程；识记囊胚包括内细胞团和滋养层两部分；明确基因工程中质粒和目的基因需要利用同种限制酶进行切割；掌握目的基因检测和鉴定的一般方法等．