[题目]骨缺损治疗是临床工作的一大挑战.骨髓间充质干细胞常用于骨和软骨的再生.但不适合长期培养.科学家基于CRISPR/Cas9同源定向修复(HDR)机制.将永生化癌基因SV40T靶向整合到小鼠Rosa26基因座.建立了永生化的BMSC.使用腺病毒载体转染BMP-9后可以有效地诱导异位成骨.HDR机制的原理是:用单个具有引导作用� 题目和参考答案——青夏教育精英家教网—

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【题目】骨缺损治疗是临床工作的一大挑战。骨髓间充质干细胞常用于骨和软骨的再生，但不适合长期培养。科学家基于CRISPR/Cas9同源定向修复（HDR）机制，将永生化癌基因SV40T靶向整合到小鼠Rosa26基因座，建立了永生化的BMSC，使用腺病毒载体转染BMP-9后可以有效地诱导异位成骨。HDR机制的原理是：用单个具有引导作用的sgRNA引导Cas9核酸酶对DNA进行定点切割（图1），DNA双链发生断裂后，在同源模板DNA存在时，通过HDR途径，根据模板供体DNA序列在预定位点精确整合DNA序列（图2）。回答下列问题：

（1）sgRNA之所以能引导Cas9核酸酶对DNA进行定点切割，是因为其序列能与小鼠DNA特定位点（靶位点）进行____________。据此分析，需确定靶位点序列在基因组中唯一性的原因是___________________________。

（2）运用CRISPR/Cas9系统时，可将sgRNA和Cas9mRNA元件导入小鼠的受精卵，使用的方法是____________。还可通过腺病毒将CRISPR系统运送到细胞内，腺病毒能够感染分裂和非分裂细胞，且不会将其DNA整合到宿主细胞基因组中，为基因治疗设计的腺病毒应具备的特点是_______________________（至少答出两点）。

（3）可提取小鼠的基因组DNA作为模板，利用PCR技术检测SV40T基因是否成功整合到小鼠Rosa26基因座中。利用PCR技术扩增目的基因时应使用____________种引物，需要合成引物的原因是__________________。

【答案】碱基互补配对防止基因组中存在一段以上能与sgRNA进行碱基互补配对的序列，从而避免其他基因被破坏显微注射法具有标记基因；有一个或多个限制酶的识别和切割位点两 Taq 酶只能聚合单个脱氧核苷酸到已有的核苷酸链上，不能从头合成DNA

【解析】

基因工程的基本内容包括：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。

根据题意分析可知，sgRNA能引导Cas9核酸酶对DNA进行定点切割，图1,2所示为基因工程中构建目的基因的步骤。

（1）sgRNA之所以能引导Cas9核酸酶对DNA进行定点切割，是因为其序列能与小鼠DNA特定位点（靶位点）进行碱基互补配对。需确定靶位点序列在基因组中唯一性的原因是防止基因组中存在一段以上能与sgRNA进行碱基互补配对的序列，从而破坏其他基因。

（2）将sgRNA和Cas9mRNA元件导入小鼠的受精卵，使用的方法是显微注射法。通过腺病毒将CRISPR系统运送到细胞内，为基因治疗设计的腺病毒应具备的特点是具有自我复制能力、具有标记基因、有一个或多个限制酶的识别和切割位点。

（3）利用PCR技术扩增目的基因时应使用两种引物，需要合成引物的原因是Taq酶不能从头合成DNA，只能聚合单个脱氧核苷酸到已有的核苷酸链上。

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（4）G过程中，当胚胎发育到囊胚时期时，可采用胚胎分割技术同时获得多个胚胎，在胚胎分割时，要注意________________，否则会影响胚胎的恢复和进一步的发育。同时滋养层细胞___________（填“能”或“不能”）用于性别鉴定。

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（3）如图所示，②表示染色体的___________，一开始SAC蛋白位于②上，如果

②_____________________，SAC蛋白会很快失活并脱离②，当所有的SAC蛋白都脱离后，细胞进入图D所示的时期，APC被激活。注: APC-后期促进因子

（4）此机制出现异常，经常会导致子细胞中染色体数目改变，请结合已有知识解释本检验机制对有丝分裂正常进行的意义_______________________________________。

（5）体外培养甲状腺细胞，待细胞进入快速增殖期，分别加入浓度为0、1、10、50mmol/L的KI溶液处理24h。收集各组培养液测定乳酸脱氢酶（LDH）含量，计算LDH漏出率。取各组培养的细胞，检测并分析细胞周期及细胞凋亡率。实验结果如下：

KI（mmol/L）	LDH漏出率	G1期	S期	G2—M期	凋亡率
0	34．07%	60．09%	32．59%	7．15%	9．64%
1	37．47%	59．69%	34．04%	6．29%	10．48%
10	37．39%	60．39%	35．04%	6．28%	10．80%
50	43．27%	72．84%	18．66%	8．50%	14．76%

（注：分裂间期分为G1期、S期、G2期，其中S期为DNA分子复制期；M表示分裂期）

① LDH是细胞内含有的酶，LDH漏出率的测定结果说明_____________________。

② 细胞周期是细胞正常生长的关键，50mmol/L KI作用于甲状腺细胞24h，细胞周期会阻滞细胞于_______期进行DNA修复，如果无法修复，就会诱导细胞_______。

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