Question

【题目】下图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使无色的X—gal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列。请回答下列问题：

⑴若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有__________和___________。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有_______、终止子和标记基因等。对获取的目的基因可用_________技术对其扩增。

⑵实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了__________；若大肠杆菌菌落显白色，说明导入了_________。没有导入任何外源DNA的大肠杆菌_______(填“能”或“不能）在该培养基上生存。

⑶将若干个质粒和目的基因用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，若仅考虑质粒与目的基因相连接，会有________种连接方式。然后再用BamHⅠ和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.8kb、3.8kb、1.1kb和3.5kb四种长度的DNA片段，则目的基因的长度为______kb(已知目的基因的长度大于2kb，1kb=1000个碱基对）。

Answer 1

【答案】 X—gal 氨苄青霉素 启动子 PCR(多聚酶链式反应） 没有目的基因的空质粒 重组质粒 不能 两 2.7

【解析】试题分析：分析质粒和含目的基因的DNA片段上存在的限制酶识别位点可知，为了保证切割的目的基因能插入切开的质粒切口，必须要求切开的质粒切口和目的基因两端露出的碱基序列相同，才能配对连接，所以必需选择BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割。结合图示，BamHⅠ会将标记基因Lac Z破坏，所以如果在LacZ处成功插入目的基因后，培养基中加入X-gal后不变为蓝色，而呈白色。但标记基因Amp没有被破坏，所以不管是否插入了目的基因的质粒，在加入有氨苄青霉素的培养基中，含有该质粒的细菌都能正常生长。

（1）由图知，质粒上含有LacZ和Amp两个标记基因，根据质粒和目的基因的酶切位点可知，若大肠杆菌中含有成功导入了目的基因的重组质粒，则不能使无色的X-gal变为蓝色，但具备氨苄青霉素抗性。故若想筛选到成功导入目的基因的重组质粒，应在培养基中加入X-gal和氨苄青霉素，只有成功导入了质粒的细菌才能不被氨苄青霉素杀死，同时表现为白色。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等。PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。

（2）由图知，若目的基因成功导入质粒中，则质粒上原有的LacZ基因被破坏，含重组质粒的细菌不能使无色的X-gal变为蓝色。故若培养基上的大肠杆菌菌落显蓝色，说明质粒中不含有目的基因，LacZ基因没有被限制酶切开，仍然具备使X-gal变色的能力。没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不能抵抗氨苄青霉素的攻击而死亡，不能在筛选培养基上生存。

（3）根据碱基互补配对原则，可知BamH和Bgl两种限制酶的识别位点如下图所示：

可知其产生的黏性末端序列相同，可用DNA连接酶连接，但连接后的序列不能再被这两种限制酶识别。因此再用BamH和EcoR切割连接产物，重组质粒上目的基因的两端中必定有一端无法被BamH识别，而另一端正常被BamH切开，即存在下图的两种情况：

根据产物片段的长度对应图中两种情况，可知质粒总长度为4.6kb，目的基因的长度为3.8kb—1.1kb=2.7kb。