Question

20．回答下列关于基因工程的问题．
外源基因需要导入受体细胞才能实现其表达功能．下图示一种外源基因导入受体细胞的方法，请据图分析回答：

（1）图所示的导入方法称为显微注射法．在动物基因工程中，受体细胞通常采用受精卵．
基因工程操作步骤中，需要从受体细胞群中筛选出已获得目的基因的细胞，下图①-③示一种筛选方法的过程．
pBR322质粒含有两个抗性基因，分别是Amp（氨苄青霉素）抗性基因和Tet（四环素）抗性基因，其中在Tet抗性基因上有下列目的基因的插入位点（插入将导致Tet抗性基因功能性失活），请据图分析回答：

（2）图中①过程所需的酶是DNA连接酶（DNA连接酶和限制酶）．
（3）经过①过程，pBR322质粒可能出现的两种结果A是目的基因成功插入（重组质粒）、目的基因插入不成功（没有发生重组的质粒）．
（4）②过程表示用含四环素（使细胞停止生长，但不致死）和环丝氨酸（使生长的细胞致死）的培养基中培养细菌甲，则培养结果C表示在培养基中可能存活的细菌包括导入不成功的细菌和导入了重组质粒的细菌．
（5）若要进一步筛选出符合要求的受体细胞D，则③过程需要做的处理是（请参照过程②的方法）将存活的细菌转移到含氨苄青霉素的培养基上培养．
基因工程中使用的Ⅱ型限制性核酸内切酶通常可以识别长度为4-8个核苷酸的特异序列．下列图示限制酶Sau3AⅠ对DNA片段切割的结果．

（6）请据图分析，Sau3AⅠ的识别序列以及切割位点（用“↓”表示）是↓GATC．
下表列出了几种限制酶的识别序列及其切割位点，图1（含两个抗性基因的质粒）和图2（含目的基因的外源DNA）中箭头表示相关限制酶的酶切位点，请据图分析回答：

限制酶	XhoⅠ	BclⅠ	SalⅠ	BamHⅠ	XbaⅠ
识别序列及酶切位点	C↓TCGAG	T↓GATCA	G↓TCGAC	G↓GATCC	T↓CTAGA

（7）为了使目的基因和质粒实现定向连接和便于受体细胞的筛选，切割质粒的限制酶应选用XbaⅠ和BamHⅠ，切割含目的基因的外源DNA的酶应选用XbaⅠ和BclⅠ．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；在动物基因工程中，受体细胞通常采用受精卵，因为受精卵的全能性最高．
（2）图中①表示基因表达载体的构成过程，该过程首先需要采用限制酶切割外源DNA分子和运载体，其次还需要用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子．
（3）经过①过程，pBR322质粒可能出现的两种结果A，即目的基因成功插入（重组质粒）、目的基因插入不成功（没有发生重组的质粒）．
（4）构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，因此②过程中用含四环素（使细胞停止生长，但不致死）和环丝氨酸（使生长的细胞致死）的培养基中培养细菌甲时，则培养结果C表示在培养基中可能存活的细菌包括导入不成功的细菌和导入了重组质粒的细菌．
（5）构建基因表达载体时，氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，因此若要进一步筛选出符合要求的受体细胞D，则③过程需要将存活的细菌转移到含氨苄青霉素的培养基上培养．
（6）由图可知，Sau3AⅠ的识别序列以及切割位点是↓GATC．
（7）目的基因上有限制酶BamHⅠ的切割位点，则不能用该酶切割外源DNA分子，因此为了使目的基因和质粒实现定向连接和便于受体细胞的筛选，切割含目的基因的外源DNA的酶应选用XbaⅠ和BclⅠ；由于BclⅠ和BamHⅠ切割后产生的黏性目的相同，因此切割质粒的限制酶应选用XbaⅠ和BamHⅠ．
故答案为：
（1）显微注射法    受精卵
（2）DNA连接酶（DNA连接酶和限制酶）
（3）目的基因成功插入（重组质粒）       目的基因插入不成功（没有发生重组的质粒）
（4）导入不成功的细菌和导入了重组质粒的细菌
（5）将存活的细菌转移到含氨苄青霉素的培养基上培养
（6）↓GATC
（7）XbaⅠ和BamHⅠXbaⅠ和BclⅠ

点评 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，能结合图中信息准确答题，属于考纲理解和应用层次的考查，有一定难度．