Question

19．图1为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp^R为青霉素抗性基因，tct^R为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点．已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点．
（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有目的基因-载体连接物、载体-载体连接物、目的基因-目的基因连接物三种．若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化．
（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验．之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是载体-载体连接物；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是目的基因-载体连接物．
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是启动子，其合成的产物是RNA．
（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ．
（5）请在图2中画出某DNA片段被切割形成黏性末端的过程示意图．
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Answer 1

分析 用上述两种限制酶同时切割目的基因后，目的基因的两个黏性末端不同，这样目的基因就不会自连成环状．同样用上述两种限制酶同时切割质粒后，质粒的两个黏性末端也不同，这样质粒也不会自连．这样当把切割后目的基因和切割后质粒混合后，只有目的基因和质粒才能相连．产物中只有重组质粒，而无其他的连接产物．

解答 解：（1）由于含有目的基因的DNA片段和质粒上均含有EcoRI酶的切割位点，所以用此酶切割后产生相同的黏性末端．这样，具有相同黏性末端的片段用DNA连接酶均可连接，从而产生3种连接产物，目的基因-载体连接物、载体-载体连接物、目的基因-目的基因连接物，所以要进行分离纯化．
（2）由于将细胞放入含四环素的培养基，要将存活tct^R 为四环素抗性基因结构要保持完整，用EcoRI酶切后再用连接酶连接的三种产物只有载体-载体连接物基因结构保持完整；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是目的基因-载体连接物．
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是启动子，其合成的产物是RNA．
（4）防止目的基因和基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，需要有两种限制酶，而amp^R为青霉素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点，结构不能被破坏，故选择EcoRⅠ和BamHⅠ这两种限制酶．
（5）DNA片段被切割形成黏性末端的过程示意图为：
故答案为：
（1）目的基因-载体连接物      载体-载体连接物      目的基因-目的基因连接物      分离纯化  
（2）载体-载体连接物  目的基因-载体连接物
（3）启动子              RNA
（4）EcoRⅠ和BamHⅠ
（5）

点评 本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生能运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或的能力．学生基因工程工具原理的应用理解不到位，特别是2种工具酶与获取目的基因和表达载体之间的联系与拓展．