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    【题目】下图表示利用基因工程培育抗虫马铃薯的过程。请据图回答下列问题：

    (1)为在短时间内获得大量目的基因，可用PCR技术进行扩增，其原理是________________________________

    (2)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是一一，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是一一，那么在①过程中，应用限制酶______________________切割质粒，用限制酶___________________切割抗虫基因，才能至少保留一个标记基因。

    (3)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是_____________________别和结合的部位。

    (4)通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有___________________的培养基上，若大肠杆菊能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。

    (5)将目的基因导人马铃薯细胞使用了农杆菌转化法，要用___________处理土壤农杆菌，使之转变为感受态，然后将它们在缓中液中混合培养以完成转化过程。目的基因导入马铃薯细胞后，是否可以稳定存在和表达，要通过检测与鉴定。在分子水平上检测马铃薯的DNA上是否插入了目的基因的方法是_______________

    __________________________________________________。

    【答案】DNA双链复制 Ⅱ Ⅰ(或答Ⅰ和Ⅱ) RNA聚合酶 四环素 Ca2+ DNA分子杂交技术

    【解析】

    图中过程①表示基因表达载体的构建，②表示目的基因导入大肠杆菌，③表示目的基因导入土壤农杆菌，④表示目的基因导入植物的根细胞，⑤表示通过植物组织培养技术获得完整植株。

    (1) PCR技术是利用DNA双链复制的原理，需要目的基因、引物、四种脱氧核糖核苷酸、热稳定DNA聚合酶和一定的缓冲溶液等。

    (2) 质粒中两个标记基因中均有限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，若用该酶切，抗性基因均被破坏，因此用限制酶Ⅱ切割质粒；目的基因可以用限制酶Ⅰ或两种酶一起切割，由于两种切割形成的末端序列相同，因此可以连接，才能至少保留一个标记基因。

    (3) 启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。

    (4) 重组质粒的标记基因是四环素抗性基因，所以将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有四环素的培养基上，能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。

    (5) 将目的基因导入马铃薯细胞使用了农杆菌转化法。该方法先将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T—DNA上，然后通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞并插入到植物细胞的染色体DNA上。导入农杆菌时，要用Ca2+处理微生物（土壤农杆菌），使之转变为容易吸收周围环境中DNA分子的感受态，进而使外源基因容易导入，然后将它们在缓冲液中混合培养以完成转化过程。DNA上是否插入了目的基因的检测方法是DNA分子杂交技术。

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