Question

【题目】鸡干抗素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①-④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_____________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了______________和_____________序列，以便于后续的剪切和连接。

(2)步骤②所构建的基因表达载体中末标注出的必需元件还有_______________________，步骤③中需先用__________________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

(3)步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过逆转录获得DNA，再通过PCR扩增制备探针，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是_________________________。

(4)用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数(植物受病毒侵染的严重程度)为100的平台期，而转基因植株在第______天才进入平台期，但此时的病情指数为79，说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有_______________________________。

Answer 1

【答案】鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 复制原点 Ca2+ 鸡干扰素基因未能导人烟草愈伤组织细胞(或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录) 22 实验得到的干扰素表达量较低,未能很好启动机体产生抗性;(或:病毒接种量过大,相对来说干扰素诱导调控作用滞后;或:植物体内缺乏干扰素受体,导致外源基因表达的干扰素诱导或调控作用减弱)

【解析】

基因工程的工具：限制酶、DNA连接酶、运载体。

基因工程的操作步骤：目的基因的获取；构建基因表达载体（基因工程的核心步骤）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、钙离子处理法、农杆菌转化法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平、个体水平）。

①获取目的基因、②构建基因表达载体、③把目的基因导入农杆菌细胞、④目的基因的筛选和鉴定。

（1）进行PCR时，需要根据已知目的基因即鸡干扰素基因两端的一段序列合成引物，为了便于后续的限制酶的剪切和DNA连接酶的连接，应该在两种引物的一端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，即GAATTC和GGATCC。

（2）②构建基因表达载体应该含有目的基因、启动子、终止子、标记基因和图中未标出的复制原点。③把目的基因导入农杆菌细胞，因为农杆菌是微生物，需要经过钙离子处理，使其处于感受态。

（3）若在愈伤组织细胞中通过DNA分子杂交法未检测出干扰素基因，可能是鸡干扰素基因未成功导入烟草愈伤组织细胞中。

（4）由图可知，普通烟草在接种后第19天对照组植株进入病情指数(植物受病毒侵染的严重程度)为100的平台期，而转基因植株在第22天才进入平台期，但此时的病情指数为79，可能是因为实验得到的干扰素表达量较低，未能很好的启动机体产生抗性，使得抗性比较低。