Question

【题目】在基因工程的操作过程中，有多种方法可检测目的基因是否导入受体菌。回答下列问题：

（1）PCR检测法：根据一段已知目的基因的核苷酸序列设计______________，对受体菌DNA进行扩增，经过解链、______________、延伸三个步骤的循环，检测PCR产物的长度是否与目的基因一致。

（2）荧光蛋白基因筛选法：某种荧光蛋白（GFP）在紫外线照射下会发出绿色荧光。用_____________酶将目的基因和GFP基因拼接成融合基因，并与____________重组后导入受体菌，经培养筛选能发出绿色荧光的菌落。

（3）环丝氨酸辅助筛选法：四环素能使细菌停止生长但不致死；环丝氨酸能使正常生长的细菌致死，而对停止生长的细菌不致死。某质粒如图所示（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因），Tetr中插入目的基因后失活。用此质粒构建表达载体，转化细菌后，结果有3种：未转化的细菌、含质粒的细菌、含重组质粒的细菌。

①用含有__________和____________的培养基对上述3种细菌进行筛选，只有含质粒的细菌被淘汰，理由是______________；

②在上述筛选的基础上，若要筛选出含重组质粒的细菌，还需使用含有的______________培养基。

Answer 1

【答案】引物 复性（退火） DNA连接 运载体 四环素 环丝氨酸 含质粒的细菌有Tetr，四环素对其不起作用，环丝氨酸使其致死 氨芐青霉素

【解析】

PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的，DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，PCR反应过程是：变性→复性→延伸。基因工程操作中要用到限制酶、DNA连接酶、载体，限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，DNA连接酶用于连接目的基因和载体；根据质粒图显示，质粒中含有Ampr和Tetr，目的基因的插入位点位于Tetr中，转化细菌后有3种结果：未转化的细菌、含质粒的细菌、含重组质粒的细菌，其中未转化的细菌在含四环素的培养基上停止生长，含质粒的细菌在四环素和氨苄青霉素培养基上能生长，含重组质粒的细菌在含四环素的培养基上停止生长，但在含氨苄青霉素的培养基上能生长。

（1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物；对受体菌DNA进行扩增，经过解链、复性、延伸三个步骤的循环，检测PCR产物的长度是否与目的基因一致。

（2）荧光蛋白基因筛选法：某种荧光蛋白（GFP）在紫外线照射下会发出绿色荧光。用DNA连接酶将目的基因和GFP基因拼接成融合基因，并与运载体重组后导入受体菌，经培养筛选能发出绿色荧光的菌落。

（3）①用含有四环素和环丝氨酸的培养基对上述3种细菌进行筛选，只有含质粒的细菌被淘汰，原因是含质粒的细菌有Tetr，四环素对其不起作用，能正常生长，而环丝氨酸能使其致死。

②四环素能使细菌停止生长但不致死，环丝氨酸能使正常生长的细菌致死，而对停止生长的细菌不致死，先在含有四环素和环丝氨酸的培养基上筛选出未转化的细菌和含重组质粒的细菌，未转化的细菌在含四环素培养基上停止生长，环丝氨酸不使其致死，含重组质粒的细菌由于四环素抗性基因被破坏，故在含四环素培养基上停止生长，而环丝氨酸对其不致死，重组质粒在含氨苄青霉素的培养基上能生长，若要筛选出含重组质粒的细菌，还需使用含有的氨芐青霉素培养基。