Question

【题目】嗜热链球菌属于一种乳酸菌。分离出优质的嗜热链球菌是酸奶工业中的关键环节，以下是嗜热链球菌的有关分离纯化与鉴定过程，请回答相关问题。

第一步：从国家乳业技术中心获得混合发酵剂（含多种乳酸菌），用无菌生理盐水梯度稀释。

第二步：取等量不同稀释度的菌液分别接种于Elliker培养基，在相同且适宜条件下培养。

第三步：选取疑似菌落分别穿刺接种于ABC三种糖发酵半固体培养基（成分及现象如下表）中培养，进一步进行生化鉴定。

成分（g）	胰蛋白胨	牛肉膏	葡萄糖	蔗糖	麦芽糖	溴甲酚紫	NaCl	琼脂	现象
A培养基	10	3.0	5.0	无	无	0.04	5.0	5.0	紫色变为黄色
B培养基			无	5.0	无				紫色变为黄色
C培养基			无	无	5.0				不变色
说明	1.溴甲酚紫是一种酸碱指示剂，在中性时为紫色，碱性时为深红色，而在酸性时呈现黄色。 2.将上述成分溶解，pH调为7，用蒸馏水定容至1000mL；

第四步：将生化鉴定为嗜热链球菌的疑似菌落进行扩大培养并保存。

（1）第一步中稀释的目的是______________________。

（2）在第二步中，利用的接种方法是____________，可根据菌落__________特征来选取疑似菌落。（写出两点）

（3）第三步中，如果接种的疑似菌落确实是嗜热链球菌，根据生化鉴定现象归纳其代谢特点为：利用___（葡萄糖/蔗糖/麦芽糖）作为主要碳源，并可以经_____（无氧/有氧）呼吸的方式分解底物，且在代谢产物中一定有____（酸/碱/中）性产物产生。NaCl的主要作用是_________。

（4）第四步中，如果要长期保存分离出的菌种常采用___________________的方法，并将其置于_____ ℃ 冷冻箱中保存。

Answer 1

【答案】便于形成单菌落，利于微生物的分离纯化(将细胞分散，便于形成单菌落） 稀释涂布平板法 形状、大小、隆起程度、颜色、凸起等 葡萄糖和蔗糖 无氧 酸 维持正常的渗透压、提供无机盐 甘油管藏 -20

【解析】

本题涉及微生物的培养与分离，考查对培养基成分、接种方法、菌种保存方法的理解和识记。乳酸菌在代谢中可产生乳酸，使培养基表现为酸性，结合表中实验结果可判断嗜热链球菌的主要碳源，根据穿刺接种方法可判断其异化作用方式。

（1）第一步中稀释的目的是降低菌体密度，以便于在固体培养基上形成单菌落，利于微生物的分离纯化。

（2）在第二步中，取不同稀释度的菌液接种，应采用稀释涂布平板法，不同菌种的菌落形状、大小、隆起程度、颜色、凸起等特征不同，据此可选取目的菌的菌落。

（3）第三步中，如果接种的疑似菌落确实是嗜热链球菌，根据实验结果可知，培养基中含有葡萄糖或蔗糖时，培养基变为黄色，说明嗜热链球菌利用葡萄糖或蔗糖作为主要碳源，且在代谢产物中一定有酸性产物产生；接种时采用穿刺接种，避免菌种接种氧气，说明嗜热链球菌经无氧呼吸的方式分解底物，NaCl作为无机盐，可以维持培养基正常的渗透压，维持菌体正常的生命活动。

（4）甘油在菌种冷冻保存时作为保护剂及防冻剂，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。长期保存分离出菌种常采用甘油管藏的方法，并将其置于-20℃冷冻箱中保存，以降低其代谢速率。

比较项目	平板划线法	稀释涂布平板法
关键操作	接种环在固体平板培养基表面连续划线	一系列的梯度稀释；涂布平板法操作
注意事项	每次划线前后均需灼烧接种环	稀释度需足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取	在具有显著菌落特征的区域的菌落中跳去菌体	从适宜稀释浓度的平板上的菌落中跳去菌体
优点	可以根据菌落特征获得某种微生物的单细胞菌落	既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数
缺点	不能对微生物计数	操作复杂，需要涂布多个平板