Question

3．如图是分离、纯化及保存枯草芽孢杆菌菌株的过程示意图：将土壤表层土稀释液煮沸十五分钟（枯草芽孢杆菌的芽孢不会失去活性）静置5分钟后获得样品，进行如图操作：

请回答下列问题：
（1）题中煮沸对目的菌种起到选择（除去其它不产生芽孢的杂菌）作用．
（2）图中进行划线操作前须用灼烧灭菌（灼烧）法对接种环进行灭菌．对于使用频繁的菌种可接种到图中的固体斜面 培养基中临时保藏，对于需要长期保存的菌种可用甘油管藏法．
（3）用稀释涂布平板法在5个培养基平板上，均接种稀释倍数为10⁴的样品液0.1ml，培养一段时间后，平板长出来的菌落数分别为13、160、532、175和187．每ml样品中的细菌数量为1.74×10⁷ 个；
（4）用（3）所述方法统计的菌落数往往比样品中活菌的实际数目少，原因是两个或者多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落．

Answer 1

分析 1、微生物常见的接种的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养．在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落．
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落．
2、统计菌落数目的方法
（1）显微镜直接计数法
 ①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量；②方法：用计数板计数； ③缺点：不能区分死菌与活菌．
（2）间接计数法（活菌计数法）
 ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌．通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌．
②操作
a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性．
b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数．
③计算公式：每克样品中的菌株数=（c÷V）×M，其中c代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数．

解答 解：（1）根据题意可知，枯草芽孢杆菌的芽孢在高温下不会失去活性，因此除用选择培养基外，还有煮沸操作起到筛选作用．
（2）图中进行划线操作前须用灼烧灭菌（灼烧）法对接种环进行灭菌．对于使用频繁的菌种可接种到图中的固体斜面  培养基中临时保藏，对于需要长期保存的菌种可用甘油管藏法．
（3）用稀释涂布平板法在5个培养基平板上，均接种稀释倍数为10⁴的样品液0.1ml，培养一段时间后，平板长出来的菌落数分别为13，160，532，175和187．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，因此每毫升样品中的细菌数量为=$\frac{160+175+187}{3}$×$\frac{1}{0.1}$×10⁴=1.74×10⁷个．
（4）由于两个或者多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此用上述方法统计出的菌落数往往比样品中活菌的实际数目少．
故答案为：
（1）选择（除去其它不产生芽孢的杂菌）
（2）灼烧灭菌（灼烧）      固体斜面       甘油管藏
（3）1.74
（4）少    两个或者多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落

点评 本题考查微生物的分离和培养，要求考生识记接种微生物常用的两种方法；识记无菌技术；识记计数微生物常用的方法，能结合所学的知识准确答题．