Question

7．CTB是霍乱弧菌产生的肠毒素（蛋白质）结构的一部分，可用作针对霍乱弧菌的疫苗．研究人员提取了控制CTB合成的基因（ctb），构建基因表达载体（如图所示），将其导入番茄，然后用转基因番茄饲喂试验小鼠，检测疫苗的有效性．请回答相关问题：
（1）为了在短时间内获得大量基因，可以采用PCR技术．与细胞内DNA复制时的解旋过程相比，该技术的DNA解链过程有何不同？不需要解旋酶（写出一点即可．）
（2）使用两种限制酶切割载体可防止切开的载体的两个末端重新连接起来，原因是两种限制酶切割载体可以产生不同的末端．
（3）可采用农杆菌转化法方法将基因表达载体导人番茄细胞，然后在加入了卡那霉素的培养基中进行初步筛选，之后还需用DNA分子杂交方法检测ctb基因是否整合到番茄染色体的DNA上．
（4）提取转基因番茄不同部位的蛋白质进行检测，发现只有果实中含有CTB．ctb基因只能在果实细胞中表达，这与基因表达载体中的E8启动子有关．
（5）用转基因番茄果实饲喂试验小鼠，若能在小鼠的血清中检测到CTB抗体，则说明该转基因疫苗是有效的．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）PCR技术可在体外大量扩增目的基因；与细胞内DNA复制时的解旋过程相比，该技术的DNA解链过程不需要解旋酶，通过高温变性来实现解旋．
（2）两种限制酶切割载体可以产生不同的末端，因此使用两种限制酶切割载体可防止切开的载体的两个末端重新连接起来．
（3）将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；由图可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此在加入卡那霉素的培养基中进行初步筛选；检测目的基因是否导入受体细胞常用DNA分子杂交技术．
（4）ctb基因只能在果实细胞中表达，这与基因表达载体中的E8启动子有关．
（5）转基因疫苗若是有效的，则会表达产生CTB，CTB能引起机体发生免疫反应产生相应的抗体，即CTB抗体．
故答案为：
（1）PCR    不需要解旋酶
（2）两种限制酶切割载体可以产生不同的末端
（3）农杆菌转化法   卡那霉素     DNA分子杂交
（4）E8启动子          
（5）CTB抗体

点评 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确判断各选项．