Question

【题目】白细胞介素-1（IL-1）是重要的炎性介质之一，也是一种热原质成分，具有致热和介导炎症的作用。它主要在细胞免疫激活中发挥调节作用。某项目小组利用基因工程技术大量合成IL-1，在pBV220载体（图A）多克隆位点的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间插入目的基因IL1-His，构建表达载体pBV-IL1-His（图B）。转化感受态细胞（大肠杆菌），通过选择性培养基（Ampr）和菌体PCR法筛选重组子阳性克隆。在适宜条件下培养并诱导目的蛋白的表达，最后利用His抗体进行蛋白质印迹检测表达情况。

（1）在上述实验中，为了防止目的基因和pBV220载体在酶切后的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是______________________。目的基因的长度为______pb（重组质粒上目的基因的插入位点与酶切位点之间的碱基对忽略不计）。pBV-IL1-His表达载体除了氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、目的基因外还必须具有______________________等基因。

（2）转化感受态大肠杆菌时需要用________处理细胞。利用PCR技术体外扩增DNA时，需将双链DNA加热到90℃以上，目的是___________________________。

（3）最后是通过________________技术来检验实验是否成功。假设未检测出目的蛋白，分析可能的原因有______________________________。（写出一种即可）

Answer 1

【答案】 EcoRⅠ和BamHⅠ 487 启动子、终止子 Ca2+ 使双链DNA变性，解聚为单链 抗原—抗体杂交 目的基因在受体细胞中没有表达

【解析】试题分析：据图可知酶切时应选用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，形成不同的黏性末端，这样可以防止目的基因和pBV220载体在酶切后产生的末端发生任意连接，用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，据此答题。

（1）酶切时应选用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，形成不同的黏性末端，这样可以防止目的基因和pBV220载体在酶切后产生的末端发生任意连接。原来载体长度为3666pb，重组后为4153pb，所以目的基因长度为487pb。基因表达载体构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。因此一个基因表达载体的组成应该包括启动子、终止子、标记基因及目的基因等。

（2）用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。利用PCR技术体外扩增DNA时，需将双链DNA加热到90℃以上，目的是使双链DNA变性，解聚为单链。

（3）最后利用His抗体进行蛋白质印迹检测即抗原—抗体杂交技术。假设未检测出目的蛋白，分析可能的原因有目的基因没有与pBV220载体重组成功、目的基因在受体细胞中没有表达等。