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    2．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp如即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、BboI、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，酶切位点分别为cC↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：

    （1）图1中目的基因D的一条脱氧核苷酸链中相邻两个脱氧核苷酸之间是通过磷酸二酯键键连接的，它是DNA复制时由DNA聚合酶催化形成的．
    （2）若用限制酶MboI完全切割图1中DNA片段，则产物中至少有3种不同DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被碱基对被T-A碱基对替换，再用限制酶Sma I完全切割，其产物长度分别为1327bp、661bp．
    （3）为了提髙实验成功率，需要获取大量目的基因D，可通过PCR技术对图1中的DNA分子进行扩增．
    （4）若用同种限制酶处理图1、图2中两种分子，以便构建重组质粒，最好选用的限制酶是BamHⅠ，若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，先用钙离子处理大肠杆菌，使之转变成感受态细胞．为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般先用添加含有抗生素B的培养基进行培养．

    分析 根据题意和图示分析可知：
    图1中：DNA片段含有2个限制酶MspⅠ切割位点，可被限制酶MspⅠ切割产生长度为534+2=536bp、796-2-2=792bp、658+2=660bp的三中DNA片段．基因D两侧序列为GGATCC，可被限制酶BamHⅠ切割．
    图2中：质粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割．用限制酶BamHⅠ切割破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因，因此含有重组质粒的大肠杆菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A．

    解答 解：（1）DNA一条脱氧核苷酸链中相邻两个脱氧核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接的，它是DNA复制时由DNA聚合酶催化形成的．
    （2）图1中至少含有2个限制酶MboⅠ的识别序列（↓GATC），因此用限制酶MboⅠ完全切割图1中DNA片段，产物中至少有3种不同的DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，基因D就突变为基因d，那么基因d上只有一个限制酶SmaⅠ切割位点，被限制酶SmaⅠ切割的产物长度为534+796-3=1327kb、658+3=661bp．
    （3）PCR技术可在体外大量扩增目的基因，所以为了提髙实验成功率，需要获取大量目的基因D，可通过PCR技术对图1中的DNA分子进行扩增．
    （4）由图1可知，目的基因两侧是GGATCC序列，该序列是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将质粒和目的基因D连接形成重组质粒，应选用限制酶BamHⅠ切割．若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，先用钙离子处理大肠杆菌，使之转变成感受态细胞．用限制酶BamHⅠ切割质粒后，破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因．因此，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般先用添加含有抗生素B的培养基进行培养．
    故答案为：
    （1）磷酸二酯键     DNA聚合酶
    （2）3    1327bp、661bp
    （3）PCR （多聚酶链式反应）
    （4）BamHⅠ钙离子（Ca2+）   B

    点评 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤，能结合图中限制酶的识别序列判断所选限制酶的种类，再根据抗性基因进行筛选，同时能结合图中和题中的数据答题．

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