Question

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：

（1）一个如图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有

 

个游离的磷酸基团．
（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越

 

．
（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是

 

．
（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止

 

．
（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入

 

酶．
（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了

 

．
（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在

 

的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测．

Answer 1

考点：基因工程的原理及技术

专题：

分析：第一步：目的基因的获取
（1）目的基因是指：编码蛋白质的结构基因．
（2）原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成．人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法．
（3）PCR技术扩增目的基因
①原理：DNA双链复制
②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成．
第二步：基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用．
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质．
②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端．
③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来．常用的标记基因是抗生素基因．
第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程．
（2）常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等．
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术．此方法的受体细胞多是受精卵．
将目的基因导入微生物细胞：
（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达．
第四步：目的基因的检测和表达
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术．
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交．
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交． （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定．如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状．
（5）基因文库：是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，叫做基因文库．建立基因文库的目的就是为获得大量的目的基因作准备．如果基因文库中含有一种生物的所有基因，这个基因文库就叫基因组文库．

解答： 解：
（1）由于质粒在切割前是一个环状DNA分子，因此上面没有游离的磷酸基团；当质粒被切割后形成了两个末端各有1个游离的磷酸基团，故共有2个游离的磷酸基团．
（2）SmaⅠ酶切位点越多，表示G和C这一对碱基对所占的比例就超高，而G和C之间含有三个氢键，故其热稳定性超高．
（3）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中 均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（4）构建含目的基因的重组质粒A时，选用 BamhHI 和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，同理，也可以防止质粒自身环化．
（5）为了使目的基因和质粒之间的磷酸二脂键相连，需要用DNA连接酶相连接．
（6）抗生素抗性基因是一种抗性基因，抗性基因是为了鉴别和筛选目的基因是否导入到受体细胞内．
（7）由于分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入大肠杆菌内，然后所给的培养基应为蔗糖为唯一含碳源的培养基．
故答案为：
（1）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因
（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
（5）DNA连接
（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞
（7）蔗糖为唯一含碳营养物质

点评：本题以抗病香蕉味素材，考查基因工程和植物组织培养的相关知识，意在考查考生的理解能力、识记能力和应用能力．