Question

17．EPSPS是叶绿体中的一种酶，它能催化芳香族氨基酸的合成；草甘膦是一种除草剂，它能抑制EPSPS的作用而使植物死亡．因此草甘膦的使用也会影响到农作物的正常生长．目前，已发现可以从一种抗草甘膦的大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因，若将该基因转入农作物植物细胞内，从而获得的转基因植物就能耐受高浓度的草甘膦．
（1）普通大豆施用草甘膦之后，电镜下可以看到叶绿体很快变形，其原因是氨基酸合成受阻直接影响了蛋白质的合成，使叶绿体内的其结构和功能严重受损从而使植物死亡．
（2）研究人员以大豆“黑农37”胚尖为外植体，利用农杆菌介导法将EPSPS基因成功转入大豆，大豆产生了更多的EPSPS来抵抗草甘膦，成为抗除草剂（草甘膦）大豆．
①下表分别表示4种限制性核酸内切酶的酶切位点．假设位于EPSPS基因两侧的DNA序列分别为和，则应选择表中酶2和3  进行酶切．若EPSPS基因的右侧序列如后者表所示，请在下面方框内画出经酶切后产生的两个末端的碱基序列．

酶的种类	1	2	4	4
酶切位点

②若多个如图1所示的片段甲和片段乙混合在一起，用DNA连接酶拼接得到环状DNA，其中只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有3种．

（3）要测定EPSPS基因最终是否整合到大豆的某一染色体上，可用DNA分子杂交方法，要测定EPSPS基因是否转录，可采用DNA-RNA分子杂交方法．
（4）图2是目的基因EPSPS（4.0kb，1kb=1000对碱基）与pUC18质粒（2.7kb）重组的示意图．图中Ap′是抗氨苄青霉素基因，lacZ是显色基因，其上的EcoRI识别位点位于目的基因插入位点的右侧．现用EcoRI酶切质粒，酶切后进行电泳观察，若出现长度为3kb和3.7kb的片段，则可以判断该质粒已与目的基因重组成功．（重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRI的识别位点之间的碱基对忽略不计）．

Answer 1

分析 切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶，限制酶是基因工程必需的工具酶，其特性是一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列．
分析图3可知：植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，所以A-C浇清水，都能健康成长．F虽经过了转基因处理，但是否成功还未知，所以D-F浇的水中含有草甘膦，D肯定不能健康成长，E肯定能健康成长，F未知．
一种限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．

解答 解：（1）草甘膦能竞争性抑制EPSPS的作用，而EPSPS是叶绿体中的一种酶，它能催化芳香族氨基酸的合成，所以普通大豆施用草甘膦之后死亡的原因是：叶绿体的类囊体薄膜上的蛋白质的合成受阻，使得叶绿体的结构受损，从而导致功能受损．
（2）①因为限制酶具有特异性识别的能力，对照图1和2所示，则应选择表中酶2和3同时进行酶切．画图时要注意：画出完整的DNA片段，要有两个黏性末端，化学键、碱基序列完整且正确．

②多个片段甲和多个片段乙混合，用DNA连接酶连接可形成甲甲、乙乙、甲乙三种连接方式（只考虑两个DNA片段连接），所以其中只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有3种．
（3）检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上，常用的方法是DNA分子杂交，要测定EPSPS基因是否转录，可采用DNA-RNA分子杂交方法．
（4）目的基因被酶切后形成两个片段：1.0kb和3.0kb；质粒被酶切后长度不变：2.7kb．故质粒只能和目的基因片段之一发生重组，如果成功的话将会出现两种情况：3kb和3.7kb或1.0kb和5.7kb．
故答案：
（1）蛋白质
（2）①2和3 （要求画出化学键、碱基序列完整且正确）
②3
（3）DNA分子杂交      DNA-RNA分子杂交
（4）3kb和3.7kb或1.0kb和5.7kb

点评 本题重点考查基因工程的有关知识，要求掌握基因工程的操作步骤及在生产实践中的运用；能够对基因工程中DNA片段的长短进行简单的计算，难度适中．