Question

【题目】人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度8416 bp，包含3个外显子和2个内含子，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答相关问题：

（1）上图是利用PCR技术获取人胰岛素基因的方法，该过程在缓冲液中除了要添加模板和引物外，还需要添加的物质有_________，一个DNA分子经过5轮循环，需要引物A____个，从PCR的过程和DNA分子的特点，试着写出设计引物需要注意的问题（答出2点即可）_____________________________________________。

（2）基因工程中需要DNA连接酶，根据酶的来源不同分为两类，其中“缝合”双链DNA片段平末端的是______________________，利用SDS-凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于____________________________。

（3）将获得的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，一般先用_______处理大肠杆菌细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于_________中与该类细胞混合，在一定温度下促进细胞吸收DNA分子完成转化过程。

（4）若利用图示方法获取的胰岛素基因，直接构建基因表达载体后导入大肠杆菌，能不能表达出人胰岛素，说明理由。___________________________________________。

Answer 1

【答案】四种脱氧核苷酸和热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 31 引物自身不能有互补序列、引物之间不能有互补序列、引物长度适当、引物能与目的基因两侧特异性结合、避免与扩增DNA内有过多互补的序列 T4DNA连接酶 DNA分子的大小 Ca2+ 缓冲液 不能，因为此方法获得的目的基因中含有内含子，大肠杆菌无法正常识别内含子而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，所以合成的蛋白质会出现错误

【解析】

1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取（2）基因表达载体的构建（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定。

2、采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸。

3、PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制的过程，利用DNA分子热变形原理，通过控制温度控制控制DNA分子的解聚和结合，DNA分子体内复制过程DNA的解旋是在解旋酶的作用下实现的；PCR扩增DNA片段过程最高经过n次扩增，形成的DNA分子数是2n个，其中只有2条单链不含有引物。

（1）用PCR技术扩增DNA时所需的条件：引物、模板DNA（目的基因或A基因）、原料（4种脱氧核糖核苷酸）和耐热性的DNA聚合酶等。利用PCR技术扩增目的基因，此技术的前提是具有一段已知目的基因的核苷酸序列。根据PCR过程的特点可知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，经过3轮循环可以得到所需的目的基因。循环5次，理论上至少需要26-2=62个引物，其中A引物31个。引物设计时需要注意以下几点：引物自身不能有互补序列；引物之间不能有互补序列；引物长度适当；引物能与目的基因两侧特异性结合；避免与扩增DNA内有过多互补的序列。

（2）连接DNA片段平末端的酶是T4DNA连接酶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术中分子的迁移速率主要取决于分子的大小，因此利用SDS-凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于DNA分子的大小。

（3）将人工合成的目的基因导入大肠杆菌体内，一般先用钙离子处理大肠杆菌使之成为感受态细胞。再将重组DNA溶于缓冲液中与该类细胞融合，在一定温度下促进细胞吸收重组DNA分子完成转化过程。

（4）题干信息显示图示获取的目的基因含有外显子和内含子，因此直接将含有此目的基因的表达载体导入大肠杆菌并不能表达出胰岛素，原因是大肠杆菌无法正常识别内含子而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误。