Question

【题目】下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：

（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用___________________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_____________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_____________态的大肠杆菌。

（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_____________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_____________________________。

（3）若BamHI酶切的DNA末端与BclI酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为___________________________，对于该部位，这两种酶_____________（填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。

（4）若用Sau3AI切图1质粒最多可能获得_______________种大小不同的DNA片段。

Answer 1

【答案】BclⅠ和HindⅢ DNA连接 感受态 四环素 引物甲和引物丙 都不能 7

【解析】

根据表格中限制酶的识别序列的特点可知，BamHI酶、BclI酶和Sau3AI酶切割后的黏性末端相同，故用不同限制酶切割后的黏性末端可能连接在一起。

（1）由图1可知，BamHI酶在质粒上面有两个酶切位点，作用后会破坏四环素抗性基因以及氨苄青霉素抗性基因，而且会将质粒水解成两个片段，再与目的基因连接时容易发生自身环化或产生无标记基因的重组质粒，为保证质粒上仍然保留标记基因，应选用限制酶为BclⅠ和HindⅢ。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入用钙离子处理的处于感受态的大肠杆菌内。

（2）由于重组质粒上的四环素抗性基因未被破坏，故为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，若平板上长出了菌落，说明转入了重组质粒。由图中引物延伸的方向，可知PCR复制目的基因时应选用的引物为引物甲和引物丙。

（3）根据图示中限制酶的酶切后的黏性末端可知，若BamH I酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为。所形成的新的序列不能被上述两种限制酶识别，故对于该部位，这两种酶都不能切开。

（4）由表中酶切位点可知，BamHI和BclI识别的序列中都含有Sau3AI的识别序列和切点，图1中有2个BamHI的酶切位点、1个BclI的酶切位点，所以Sau3AI在质粒上有3个酶切位点。若只有一个Sau3AI切开一个位点，得到一条最长的线性DNA分子，若有两个Sau3AI同时切开两个位点，则会形成6种不同长度的DNA片段，若三个酶切位点同时切开，则形成的三个长度的片段与前面重复，故若用Sau3AI切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。