Question

【题目】Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。其原理是重组酶Cre能识别loxP位点（特定的DNA序列），并使loxP位点间的基因序列被重组或删除。受此启发，科学家在检测抗虫基因成功导入烟草细胞后，尝试用Cre/loxP重组酶系统删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因，其技术过程如图2（其中■表示启动子）。

（1）通过基因改造获得抗虫烟草过程中，为大量获得抗虫基因，可选择图1中引物___________（用图中罗马数字表示）组合进行PCR扩增；扩增时，为确保抗虫基因和表达载体充分连接，常在基因上、下游引物的___________端添加不同的限制酶切位点，其目的是______________________。

（2）loxP是一种含34个碱基对的小型DNA片段，由一个不对称的间隔区和两个反向重复序列组成。Cre酶能特异性地识别反向重复序列并于特定位置切开磷酸二酯键，类似于基因工程中的___________酶，从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒的原理是____________。

（3）通常用___________法把携带抗虫基因的重组质粒甲导入烟草细胞，经检测导入成功后，抗除草剂基因即失去用途，继续留在烟草体内可能会引发的生物环境安全问题是_______________________。

（4）经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开，得到图2右侧的两个环状DNA分子。由于______________________，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。

Answer 1

【答案】Ⅱ、Ⅲ 5' 减少DNA自连，使抗虫基因能定向插入表达载体 限制（酶） 基因重组 农杆菌转化（法） 抗除草剂基因可能转移到杂草中，造成基因污染 质粒乙的抗除草剂基因前没有启动子

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；

（4）目的基因的检测与鉴定：可分为分子水平的检测与个体水平的检测。

（1）PCR技术扩增目的基因过程中，引物与模板链的3′端结合，子链从5′端开始延伸，故要扩增抗虫基因应选择图1中引物Ⅱ、Ⅲ；为保证抗虫基因和表达载体的充分连接，PCR扩增时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加相应的酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制酶酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。

（2）Cre酶能特异性地识别反向重复序列并在特定位置切开磷酸二酯键，其功能类似于基因工程中的限制酶（限制性核酸内切酶）；从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒相当于实现了基因间的重组，原理是基因重组。

（3）将重组质粒导入植物细胞的常用方法是农杆菌转化法；抗除草剂基因属于外源基因，若继续留在烟草体内可能会转移到杂草中，造成基因污染。

（4）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转露出mRNA，最终合成所需蛋白质。据图可知，质粒乙的抗除草剂基因前没有启动子（其中■表示启动子），故抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。