Question

7．图1为某种常用质粒的序列图，Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Ampr为氨卡青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：

（1）若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有X-gal和氨苄青霉素，构建重组质粒时需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶．
（2）采用PCR技术扩增目的基因所依据的原理是DNA双链复制．
（3）实验小组用BamHⅠ和BalⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中．在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了没有目的基因的空质粒；若大肠杆菌菌落显白色，说明导入了重组质粒．没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不能（填“能”或“不能”）在该培养基上生存．
（4）将若干个质粒和目的基因用BamHⅠ和BalⅡ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，然后再用BamHⅠ和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb四种长度的DNA片段，则目的基因的长度为1.8kb．（已知目的基因的长度大于1kb，1kb=1000个碱基对）

Answer 1

分析 根据题意和图示分析可知：质粒中，抗氨苄青霉素抗性基因（Amp'）和LacZ基因都属于标记基因，目的基因上存在BamHⅠ和BlgⅡ两种酶的酶切位点，质粒上存在BamHⅠ和EcoRⅠ两种酶的酶切位点．一般为了防止目的基因和质粒反向连接，用两种限制酶切割目的基因和质粒．

解答 解：（1）由于Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Amp为氨苄青霉素抗性基因，所以若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有X-gal和氨苄青霉素．构建重组质粒时需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶．
（2）PCR技术扩增目的基因所依据的原理是DNA双链复制．
（3）构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，由于Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入的是不含目的基因的空白质粒．若大肠杆菌菌落显白色，说明Lac Z基因被破坏，不能编码相应的酶，所以导入的是重组质粒．没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不含氨苄青霉素抗性基因，所以不能在该培养基上生存．
（4）根据BamHⅠ和BlgⅡ两种酶识别的序列为G↓GATCC、A↓GATCT．质粒上存在BamHI的切割位点，假设用a和b表示．目的基因上存在BamHⅠ和BlgⅡ两种酶的酶切位点，假设分别用c和d表示．那么目的基因与质粒链接的方式可能有两种，如图所示：

用BamHⅠ切割和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb四种长度的DNA片段．
①如果BamHⅠ切割ac处，可能的情况如图：

②如果BamHⅠ切割ac处，可能的情况如图，

据图比较可推断出目的基因的长度为1.8Kb．
故答案为：
（1）X-gal    氨苄青霉素    限制酶、DNA连接酶
（2）DNA双链复制
（3）没有目的基因的空质粒     重组质粒    不能
（4）1.8

点评 本题结合重组质粒形成示意图，考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的步骤，要求考生识记基因工程的步骤，掌握重组质粒的筛选方法，能运用所学的知识，结合题图，判断导入重组质粒的大肠杆菌能否在相应的培养基中生存．