Question

【题目】回答下列（一）、（二）小题：

（一）开发山楂果醋恰好让山楂中的有机酸丰富了果醋的酸味，同时也弥补生食山楂酸味大的缺陷，具体酿制山楂果醋分为以下三个阶段，请将具体过程补充完整。

（1）制备山楂果原汁：选成熟的山楂果，在清水冲洗山楂果_______（填“之前”或“之后”）去梗。将山楂果切片并去籽，再添加_______，酶解适宜时间后压榨取果汁。

（2）乙醇发酵：由于山楂果原汁_______，故发酵液中添加适量蔗糖，以获得酒精含量较高的果酒。果汁中加入活化的________后，在适宜环境下发酵一段时间，当发酵液中停止_______，发酵完毕待过滤，或发酵至_______，上清液即为果酒，用虹吸法取出。

（3）醋酸发酵：将醋化醋杆菌进行扩大培养后，经检查菌体生长正常并无杂菌污染后接种于山楂酒-水中进行发酵，整个发酵过程需要通入_______。在发酵后期加入0．3~0．4%的食盐，其目的是调味和_______，以防止果醋被发酵分解。

（二）下图为转基因抗虫烟草的培育流程，①②③④表示过程，其中②表示利用农杆菌转入受体细胞。回答下列相关问题：

（1）在①过程构建重组质粒时，若用同一种限制性核酸内切酶处理Ti质粒和含目的基因的DNA片段，使两者形成粘性末端用于拼接，这种方法的明显缺点是目的基因和质粒________（答出2点即可）。另外，影响拼接效率的主要因素，除以上缺点和盐离子浓度、渗透压、温度等环境因素外，还有_______（答出2点即可）。

（2）在②过程中，将图示重组Ti质粒导入农杆菌时可用______处理农杆菌，以提高转化效率。操作之后，需要特定的培养基对农杆菌进行筛选，其原因是_______，最终筛选到的对象在相应选择培养基上的存活情况是________。

（3）在③过程常通过调节_______的适当配比，从愈伤组织诱导出芽和根的_____，并由此再生出新植株。获得转基因烟草后，再通过[④]_______过程实现多个世代组织培养。

Answer 1

【答案】之后 果胶酶（和果胶甲酯酶） 含糖量较低 干酵母（悬液） 出现气泡 酵母下沉 无菌空气/氧气 抑制杂菌 反向拼接/倒接、（自身）环化 且的基因的浓度、质粒的浓度、反应时间 氯化钙CaCl2 不是所有的农杆菌都接纳了重组质粒 在含四环素培养基上存活，在含青霉素培养基上死亡 营养物质和生长调节剂/植物激素 项端分生组织 继代培养

【解析】

1.酿酒和制醋是最古老的生物技术。与酒和醋的生产有关的微生物分别是酵母菌和醋杆菌，它们各有不同的菌种。菌种的不同，所产生的酒和醋的风味也不同。本实验的内容是制作果酒和果醋，所用的原料是葡萄或其他果汁。葡萄酒是酵母利用葡萄糖进行酒精发酵(乙醇发酵)的产物。酵母菌只有在无氧条件下才能进行酒精发酵，即将葡萄糖氧化成乙醇，而且当培养液中乙醇的浓度超过16%时，酵母菌就会死亡。葡萄糖氧化成乙醇的反应式如下。

醋杆菌在有氧条件下才能将乙醇氧化为醋酸，醋杆菌所产生的醋酸可使培养液中醋酸的含量高达13%。

2. 基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

（一）（1）制备山楂果原汁通常选成熟的山楂果，为了避免杂菌污染，通常在用清水冲洗山楂果之后去梗。将山楂果切片并去籽，为了提高出汁率和澄清度，通常需要添加果胶酶（和果胶甲酯酶）处理，酶解适宜时间后压榨取果汁。

（2）乙醇发酵时通常需要在发酵液中添加适量蔗糖，以弥补山楂果原汁含糖量较低的不足，同时也是为了满足酵母菌发酵需要的底物量，从而获得酒精含量较高的果酒。然后在果汁中加入活化的干酵母（悬液）后，置于适宜环境下进行发酵，由于酵母菌无氧呼吸的产物是酒精和二氧化碳，所以在发酵过程中会有气泡产生，当发酵液中不再出现气泡时，意味着发酵完成，然后过滤获得果酒；也可发酵至酵母下沉后，用虹吸法取出上清液即为果酒。

（3）醋酸发酵中，由于醋化醋杆菌在有氧气的条件下将酒精变为为乙醛，进而变为乙醇，所以整个发酵过程需要通入无菌空气/氧气。在发酵后期加入0．3~0．4%的食盐，食盐起到了调味和抑制杂菌的作用，进而防止果醋被其他微生物发酵分解。

（二）（1）①为构建基因表达载体的过程，若用同一种限制性核酸内切酶处理Ti质粒和含目的基因的DNA片段，则两者会出现相同的粘性末端从而使得拼接变得容易，但这种方法存在明显的缺点是在拼接时会出现反向拼接/倒接、（自身）环化等情况。影响拼接效率的因素主要有盐离子浓度、渗透压、温度等环境因素，除此外，还有且的基因的浓度、质粒的浓度和反应时间也会影响拼接的效率。

（2）②过程为将目的基因导入受体细胞的过程，将图示重组Ti质粒导入农杆菌时，为了提高导入的成功率，可用氯化钙CaCl2 处理农杆菌，以提高转化效率。因为导入的成功率较低，也就是说，并不是所有的农杆菌都接纳了重组质粒，可能有的导入的是普通质粒，或者没有导入成功，所以需要在特定的培养基对农杆菌进行筛选，由于图中重组质粒上含有标记基因四环素抗性基因，而抗青霉素的基因被破坏，为了筛选出成功导入重组质粒的农杆菌，需要将待筛选的农杆菌分别接种在含有四环素的培养基和含青霉素的培养基上进行筛选，最终筛选到成功导入重组质粒的农杆菌在相应选择培养基上的存活情况是在含四环素培养基上存活，在含青霉素培养基上死亡。

（3）③过程为再分化成植株的过程，该过程中需要通过调节营养物质和生长调节剂/植物激素的适当配比，从而实现由愈伤组织诱导出芽和根的项端分生组织的目的，并由此再生出新植株。获得转基因烟草后，再通过[④] 继代培养过程实现多个世代组织培养，从而实现了转基因烟草的扩大培养。