Question

【题目】CAR-T细胞疗法是通过设计CAR基因，并导入癌症患者的T细胞中，使其转化为CAR-T细胞，CAR-T细胞膜上的CAR蛋白与癌细胞表面抗原特异结合后，激活CAR-T细胞使其增殖、分化，从而实现对癌细胞的特异性杀伤和记忆，主要过程如下图。请回答：

（1）要获取CAR基因，可采取PCR技术进行大量扩增，其原理是___________________。

（2）将CAR基因导入患者T细胞前，需完成过程①，该过程所需要的酶有__________，连接形成pCDH—CAR上除了目的基因外，还有一些必须的部分，比如__________，它可使转录在需要的地方停止下来。

（3）完成过程②的常用方法是__________法，受体细胞是__________。

（4）检测CAR-T细胞能够产生CAR蛋白所采取的方法是__________。

（5）构建好的CAR-T细胞还需要再体外进行扩增，扩增时需要定期更换培养液，这样做的目的是______________________________。

Answer 1

【答案】DNA双链的复制 限制性内切酶和DNA连接酶 终止子 显微注射法 患者的T细胞 抗原—抗体分子杂交 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害

【解析】

基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）PCR技术又叫DNA的体外扩增技术，其原理是DNA双链的复制。

（2）过程①表示基因表达载体的构建，该过程需要限制性内切酶和DNA连接酶，连接形成基因表达载体pCDH—CAR上除了目的基因外，还有启动子、终止子、标记基因等，其中终止子可使转录在需要的地方停止下来。

（3）过程②表示导入受体细胞，由图可知，其受体细胞是患者的T细胞，导入动物细胞常用方法是显微注射法。

（4）检测目的基因是否翻译成蛋白质所采取的方法是抗原—抗体分子杂交。

（5）构建好的CAR-T细胞扩增时需要定期更换培养液，这样做的目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害。