Question

【题目】下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源。当其在甲醇中培养时，AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。

资料3：限制酶酶切位点

(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上限制酶_________________的识别序列，这样设计的目的是__________________________。

(2)酶切获取HBsAg基因后，需用________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒。

(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用______________________方法进行检测。

(5)转化后的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

(6)与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是_______________________________________________________。

Answer 1

【答案】 SnaBⅠ和AvrⅡ 用两种限制酶对质粒和目的基因同时切割，可以防止目的基因和质粒发生自身环化（并且能将目的基因插在启动子和终止子之间） DNA连接酶 BglⅡ DNA分子杂交 甲醇 酵母菌为真核生物，具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对蛋白质进行加工，而细菌没有各种细胞器(除了核糖体)，不形成分泌蛋白

【解析】【试题分析】

本题考查基因工程应用的关知识，意在考查学生对相关知识的理解和掌握情况，对图表的分析判断能力。有利于培养学生搜集和处理科学信息的能力、思维能力、分析和解决问题的能力。分析题图：图中质粒上含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，SnaBⅠ、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割质粒。要获取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割。

（1）重组质粒上的目的基因若要表达，需要目的基因的首尾含有启动子和终止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，只要在目的基因两侧A和B位置分别接上这两种酶识别的序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ这两种限制酶对质粒和目的基因同时切割，便会各自出现相同的黏性末端（或平末端），便于重组与表达，同时可防止目的基因和质粒发生自身环化。因此应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ的识别序列。

（2）用DNA连接酶可将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒。

（3）重组DNA的两侧分别是启动子和终止子，除BglⅡ外，其它限制酶会破坏含有启动子、终止子的目的基因，故应该选择限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA。

（4）检测目的基因是否成功插入到受体细胞染色体，通常用DNA分子杂交技术。

（5）巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达。所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

（6）酵母菌为真核生物，细胞内具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体等细胞器，细菌等原核生物，不具有内质网和高尔基体等细胞器，不能形成分泌蛋白，所以生产乙肝疫苗的过程中，与大肠杆菌等细菌相比，巴斯德毕赤酵母菌细胞更适合作为受体细胞。