Question

14．将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力．以下是与植物疫苗制备过程相关的图．

表一引物对序列表

引物对A	P1　 AACTGAAATGTAGCTATC
	P2　 TTAAGTCCATTACTCTAG
引物对B	S1　 GTCCGACTAGTGGCTCTC
	S2　 AGCTGGCGTTTAGCCTCC

表二：几种限制酶识别序列及切割位点表

限制酶	Alu	EcoRI	PstI	SmaI
切割位点	AG↓CT	G↓AATC	CTGCA↓G	CCC↓CCC
	TC↑GA	CTTAA↑G	G↑ACGTC	GGG↑CCC

请根据以上图表回答下列问题．
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是耐高温．
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定．表1根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图．请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？引物对B．
（3）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤6转基因所用的细菌B通常为农杆菌，鉴定目的基因是否整合到细胞染色体上的方法是DNA分子杂交技术．
（4）构建符合要求的重组质粒T时需要用到的酶是限制酶和DNA连接酶酶，重 组质粒T时需要具备目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞是否含有目的基因
（5）符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断．
①采用EcoRI和PstI酶切，得到2种DNA片断．
②采用EcoRI和SmaI酶切，得到1种DNA片段．

Answer 1

分析 1、PCR技术是在体外对DNA进行扩增，所用的DNA聚合酶与体内DNA聚合酶不同，是耐高温的DNA聚合酶，过程为变性使DNA分子两条链解旋开来，复性是让引物与DNA解旋开来的单链互补配对，延伸是在DNA聚合酶的作用在引物引导下合成子代DNA分子．
2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
3、耐高温的DNA分子中通常含有G与C碱基比例大，因为它们之间有三个氢键，而A与T之间只有两个氢键．

解答 解：（1）PCR方法扩增目的基因的过程中，需要进行高温解旋过程，因此使用的DNA聚合酶要具有耐高温的特性．
（2）由于A和T之间有2个氢键，而C和G之间有3个氢键，因此C和G的含量越高，DNA分子越稳定．引物B中含C与G的碱基对较多，可采用较高的退火温度．
（3）植物基因工程中，将目的基因导入受体细胞常用农杆菌转化法，因此受体菌B通常为农杆菌．检测目的基因是否导入受体细胞常用DNA分子杂交技术．
（4）构建基因表达载体时，首先要用限制酶切割目=外源DNA分子和运载体，其次需要用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA；基因表达载体的组成包括复制原点、启动子、终止子、目的基因和标记基因等，其中标记基因的作用是鉴别受体细胞是否含有目的基因．
（5）用EcoR I酶和Alu I酶切割抗原DNA片段产生了X、Y两个片段，而用EcoR I酶和SmaI酶切割质粒产生了 M、N两个片段，且M、N片段间存在Pst I酶切点．因此再用EcoRⅠ和PstⅠ酶切割这两片段形成的重组质粒，由于保留了Pstl的切割位点，所以可以得到两种DNA分子，而用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切重组质粒中，如图1-②过程只能产生一种DNA片断．
故答案为：
（1）耐高温
（2）引物对B
（3）农杆菌   DNA分子杂交技术
（4）限制酶   DNA连接酶   启动子   鉴别受体细胞是否含有目的基因
（5）2   1

点评 本题具有一定的难度，考查了运用PCR方法扩增目的基因的有关知识，意在考查考生的图解识别能力，尤其是限制酶的作用是解答本题的难点和关键点；能够识记PCR技术中DNA聚合酶耐高温的特点；识记DNA分子中C-G碱基对稳定强．