Question

7．回答基因工程中的有关问题：
Ⅰ．限制酶是基因工程中的重要工具酶，表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图甲、图乙中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：

限制酶	BamHⅠ	HindⅢ	EcoRⅠ	SmaⅠ
识别序列及切割位点

（1）一个图甲所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有0个和2 个游离的磷酸基团？
（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高．
（3）与只使用EcoR I相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化．
Ⅱ．原核生物（如大肠杆菌）是基因工程中较理想的受体细胞，它们具有一些其他生物没有的特点：①繁殖快②多为单细胞③遗传物质相对较少等优点．大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca²⁺处理细胞，使之成为感受态细胞，然后完成转化．
Ⅲ．植物基因工程中将目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法，且一般将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中形成重组Ti质粒，这样可将目的基因整合到受体细胞的染色体上．若要避免基因污染，一般需将目的基因导入植物细胞的细胞质（线粒体、叶绿体）DNA中．

Answer 1

分析 1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．
2、DNA分子的热稳定性与DNA分子中的氢键有关，氢键数越多，DNA分子越稳定．在双链DNA分子中，A和T之间有两个氢键连接，C和G之间有三个氢键，因此C-G碱基对比例越高，DNA分子越稳定．

解答 解：Ⅰ（1）质粒是双链环状DNA，无游离磷酸基团；质粒经过切割后，会断裂2个脱氧核苷酸（CG）之间的磷酸二酯键，露出2个游离磷酸基团．
（2）插入的SmaⅠ酶切位点越多，碱基对CG越多，氢键越多，故质粒的热稳定性越高．
（3）只使用EcoRI切割时，质粒、外源DNA自身都只含有1对互补黏性末端，自身会发生连接成为环状DNA，不利目的基因导入．故使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA，各自会有不同黏性末端，能防止自身环化．
Ⅱ．原核生物（如大肠杆菌）是基因工程中较理想的受体细胞，具有一些其他生物没有的特点：①繁殖快，能大量快速复制DNA；②多为单细胞，结构简单，容易操作；③遗传物质相对较少，不易对目的基因干扰．大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca²⁺处理细胞，使之成为感受态细胞，然后完成转化．
Ⅲ．植物基因工程中将目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法．且一般将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中形成重组Ti质粒，这样可将目的基因整合到受体细胞的染色体上．要避免基因污染，一般需将目的基因导入植物细胞的细胞质（线粒体、叶绿体），不会随着花粉进行基因污染．
故答案为：
Ⅰ．（1）0   2   
（2）高 
（3）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
Ⅱ．③遗传物质相对较少  Ca²⁺   感受态
Ⅲ．农杆菌转化法  T-DNA   细胞质（线粒体、叶绿体）

点评 本题考查了DNA分子的结构和基因工程的相关知识，意在考查考生的识记能力和分析能力，难度适中．考生要能够识记目的基因导入微生物和植物细胞的方法，以及微生物作为受体细胞的优点；理解运用不同的限制酶切割可以防止自身环化；并且理解C-G碱基对与DNA分子稳定性之间的关系．