Question

如图表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：

（1）用图1中的外源DNA（含有目的基因D）和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和

 

．前者（酶）的专一性很强，其作用特点是

 

．
（2）应该使用限制酶BamHⅠ同时处理质粒、外源DNA，而不选择其他3种，原因在于

 

．（多选） A．若使用SmaⅠ或者MspⅠ会破坏目的基因．
B．若使用SmaⅠ切割质粒，能成功切开质粒得到粘性末端的可能很低．
C．若使用MboⅠ切割质粒，质粒上会有2处被切开，会将质粒切成两段不利于筛选．
D．使用限制酶BamHⅠ能保证目的基因和质粒获得相同的粘性末端，以便目的基因和运载体定向连接，不至于反向连接．
E．使用BamHⅠ切割质粒，质粒上会有1处被切开，破坏抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于将来筛选含目的基因的受体细胞．
F．只有使用BamHⅠ切割，才能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端．
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有

 

种不同DNA片段．若同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒，则可得到

 

个DNA片段．
（4）为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，一般可进行如下步骤筛选：
第一步：将大肠杆菌在含

 

的培养基上培养，得到如图3的菌落．
第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含

 

的培养基上培养，得到如图4的结果（空圈表示与图3对照无菌落的位置）．
第三步：选出图3培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的大肠杆菌．请在图3中圈出含目的基因的重组质粒的大肠杆菌的菌落
以上筛选方式至少需要两步，其实还有其他更简单的操作方法．请阅读下列材料，回答问题．
大肠杆菌pUC118质粒的某限制酶唯一酶切序列，位于该质粒的lacZ基因中．lacZ基因中如果没有插入外源基因，便可表达出β-半乳糖苷酶．当培养基中含有A物质时，A物质便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落．pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因．如图5是利用lacZ基因筛选重组质粒示意图．
（5）用图5中的培养基中筛选导入了重组质粒的受体大肠杆菌，制备时除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外还应加入物质应包括

 

（多选） A．伊红美蓝试剂  B．琼脂  C．A物质  D．氨苄青霉素  E．四环素  F．噬菌体
（6）将上述处理后的大肠杆菌置于图5中培养基上培养，以检测受体大肠杆菌是否导入重组质粒，结果可能出现蓝色或者白色菌落，其中

 

色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌．

Answer 1

考点：基因工程的原理及技术,微生物的分离和培养

专题：

分析：分析图1：图中DNA片段含有2个限制酶SmaⅠ切割位点，可被限制酶SmaⅠ切割产生长度为534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp的三中DNA片段．基因D两侧序列为GGATCC，可被限制酶BamHⅠ切割．
分析图2：质粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割．用限制酶BamHⅠ切割破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因，因此含有重组质粒的大肠杆菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A．

解答： 解：（1）用图1中的外源DNA（含有目的基因D）和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和DNA连接酶．限制酶的专一性很强，其作用特点是能够识别特点的碱基序列并加以切割．
（2）A、若使用SmaⅠ或者MspⅠ会破坏目的基因，A正确；
B、之所以不用SmaⅠ限制酶，原因是这种酶切割目的基因会破坏目的基因，利用这种酶质粒，不可能得到粘性末端，B错误；
C、若使用MboⅠ切割质粒，质粒上会有2处被切开，并且两个抗性基因均会被破坏，这将不利于筛选，C正确；
D、使用限制酶BamHⅠ切割目的基因和质粒，使目的基因和质粒获得相同的粘性末端，这会导致目的基因和运载体反向连接，D错误；
E、使用BamHⅠ切割质粒，质粒上会有1处被切开，破坏抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于将来筛选含目的基因的受体细胞，E正确；
F、利用BamHⅠ或MboⅠ切割，能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端，F错误．
（3）杂合子的基因型为Dd，其中D基因片段有两个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是537bp、790bp、661bp，发生基因突变后的d基因片段只有一个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现两个片段长度分别是1327bp、661bp，所以从杂合子中分离的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成会四种不同的DNA片段．限制酶MspⅠ在质粒上存在一个酶切位点，而限制酶MboⅠ在质粒上存在于两个酶切位点，因此同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒，则可得到3个DNA片段．
（4）分析图解可知，该基因工程中，最好选择限制酶BamHⅠ切割目的基因和质粒，但是利用该酶切割将会破坏抗生素A抗性基因，则抗生素B抗性基因为重组质粒中的标记基因．在筛选过程中，首先让大肠杆菌在含抗生素B的培养基上培养，得到图3的菌落是含有目的基因及抗生素B抗性基因的菌落；再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含抗生素A的培养基上培养，得到图4的结果，则图4中的菌落是既含抗生素B抗性基因又含有抗生素A抗性基因的菌落．所以选出图3中有但图4中对应部位没有的菌落进行培养，就可以得到含重组质粒的大肠杆菌．
（5）根据题意可知，pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因，因此制备培养基时需要加入氨苄青霉素进行筛选，同时还需要加入琼脂作为培养基的凝固剂，A物质用于鉴定lacZ基因是否被破坏．
（6）如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落．因此其中白色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌．
故答案为：
（1）DNA连接酶     能够识别特点的碱基序列并加以切割
（2）ACE
（3）4    3  
（4）抗生素B      抗生素A   
画图如右 
（5）B、C、D 
（6）白

点评：本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤，能结合图中限制酶的识别序列判断所选限制酶的种类，再根据抗性基因进行筛选，同时能结合图中和题中的数据答题．