Question

【题目】回答下列（一）、（二）小题

（一）研究小组从土壤中分离胞外脲酶高产菌株的过程如下：

（1）尿素固体培养基的配制：将葡萄糖、NaCI、K2HPO4、酚红、水和凝固剂___________按配方配置好_________，加入三角瓶并用封口膜封口后用__________法灭菌。待冷却至60℃时，加入经____处理的尿素溶液，摇动，混匀后倒平板。

（2）从___________环境中采集土样，用无菌水等梯度稀释，接种到平板。培养皿在37℃恒温培养箱中倒置培养24h后，用接种环挑选___________的菌落，接种到液体培养基中，并震荡培养48h。

（3）将培养液离心，取___________测定脲酶活性。得到的脲酶可用图___________法固定化以利于连续使用。

（二）拟利用转基因技术将北极海鱼的抗冻基因转入番茄，以提高番茄的抗冻能力，请回答：

（1）将含抗冻基因的DNA和农杆菌的___________用相应的限制性核酸内切酶切割，形成___________，再用DNA连接酶连接获得重组质粒。

（2）将重组质粒与经___________处理的农杆菌在离心管中混合，在离心管中加入液体培养基，置于___________中慢速培养一段时间，使农杆菌恢复正常状态。选用的农杆菌应是限制性核酸内切酶缺陷型菌株，原因是_________________________________。

（3）用农杆菌转化法获得含抗冻基因的番茄细胞后，经脱分化形成愈伤组织，再通过调节培养基中的___________诱导再生出新植株。

（4）请简要描述个体水平检测转基因番茄是否成功表达的实验思路：______________________。

Answer 1

【答案】琼脂糖 调节pH 高压蒸汽灭菌 G6玻璃砂漏斗/过滤灭菌 有哺乳动物排泄物的 红色环带直径与菌落直径的比值较大 上清液 交联法 Ti质粒 相同粘性末端 CaCl2 摇床 防止限制性核酸内切酶将目的基因剪切 营养物质和植物生长调节剂（植物激素）配比 将转基因番茄和正常番茄置于低温环境下，比较转基因番茄是否具有抗冻性状

【解析】

（一）细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够产生脲酶，并分解尿素。

（二）基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（一）（1）琼脂糖可作为固体培养基中的凝固剂。对培养基应先调节pH，后高压蒸汽灭菌法灭菌。待冷却至60℃时，加入经G6玻璃砂漏斗/过滤灭菌处理的尿素溶液，摇动，混匀后倒平板。

（2）脲酶将尿素分解成氨，哺乳动物排泄物中含有尿素，因此从土壤中分离胞外脲酶高产菌株时，应从有哺乳动物排泄物的环境中采集土样，用无菌水等梯度稀释，接种到平板。脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，加入酚红指示剂，指示剂会变红。因此用接种环挑选红色环带直径与菌落直径的比值较大的菌落。

（3）脲酶是细胞分泌物，离心后在上清液中。因此将培养液离心，取上清液测定脲酶活性。图示为交联法固定酶。

（二）（1）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。构建基因表达载体时，首先将含抗冻基因的DNA和农杆菌的Ti质粒用相应的限制性核酸内切酶切割，形成相同黏性末端，再用DNA连接酶连接获得重组质粒。
（2）将目的基因导入微生物细胞常采用感受态细胞法，将重组质粒与经CaCl2处理的农杆菌在离心管中混合，在离心管中加入液体培养基，置于摇床中慢速培养一段时间，使农杆菌恢复正常状态。选用的农杆菌应是限制性核酸内切酶缺陷型菌株，防止限制性核酸内切酶将目的基因剪切。
（3）用农杆菌转化法获得含抗冻基因的番茄细胞后，经脱分化形成愈伤组织，再通过调节培养基中的营养物质和植物生长调节剂（植物激素）配比诱导再生出新植株。
（4）从个体水平检测转基因番茄是否成功表达的实验思路：将转基因番茄和正常番茄置于低温环境下，比较转基因番茄是否具有抗冻性状。